单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR,技术及其应用,目 录,PCR,技术历史,PCR,的原理,PCR,的反应体系和方法,PCR,的类型和应用,PCR,技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,解旋酶,解链酶,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,PCR,技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,GGAUCG,5,AUCGCG,5,引物酶,引物酶,RNA,引物,RNA,引物,PCR,技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,GGAUCG,5,AUCGCG,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCT,3,ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG,3,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,PCR,技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,1971,年，,Khorana,提出：经过,DNA,变性，与合适引物杂交，用,DNA,聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆,tRNA,基因。,但由于测序和引物合成的困难，以及,70,年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，,Khorana,的设想被人们遗忘了,PCR,技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,1985,年，美国,PE-Cetus,公司的,Mullis,等人发明了聚合酶链反应（,PCR,）,基本原理是在试管中模拟细胞内的,DNA,复制,最初采用,E-coli DNA,聚合酶进行,PCR,，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错,耐热,DNA,聚合酶的应用使得,PCR,能高效率的进行，随后,PE-Cetus,公司推出了第一台,PCR,自动化热循环仪,1993,年，,Mullis,等因此项技术获诺贝尔化学奖,PCR,技术简介,-,定义,PCR:polymerase chain reaction,聚合酶链式反应,PCR,技术是一种体外模拟自然,DNA,复制过程的核酸扩增技术，亦称为无细胞分子克隆技术。它是以待扩增的两条,DNA,链为模板，在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下，通过耐高温,DNA,聚合酶的酶促作用，快速特异地扩增出特定的,DNA,片断。,简单的讲，,PCR,技术即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向,DNA,合成。,PCR,扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链,5,端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的,DNA,为模板，引物是从,3,端开始延伸，其,5,端是固定的，,3,端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链,(,即“长产物片段”,),结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的,5,端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段,3,端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得,PCR,的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯,DNA,片段供分析与检测用。,PCR,技术简介,PCR,反应所用酶：,早期的,PCR,方法采用大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的,Klenow,片断催化退火的寡核苷酸引物进行延伸反应。由于该酶会在进行,DNA,变性的温度下失活，所以在每一轮合成反应中都须重新加,1,份酶。并且在扩增较长模板是效果不够理想，产率较低，有一些错配，导致产物大小不均一。,耐热,DNA,聚合酶是从一种嗜热细菌嗜热水生菌种提纯出来的，经,95,持续温育仍有活性，不会在加热变性中失活，故无需每轮反应都重新加酶，又由于寡核苷酸引物的退火和变性可以在更高温度下进行，使引物和模板间的误配大大减少，提高了扩增反应的特异性和产率，并且可以扩增更长的产物。,Taq,DNA,聚合酶（,thermus aquaticus),酶活性,(%),温度,(),40 50 60 70 80 90 100,100,80,60,40,20,72,94,55,PCR,循环,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,13,步,2530,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,PCR,中后期，随着目的,DNA,扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，,DNA,扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。,操作方法,1 在PCR反应管中加入buffer,2.5ul,2 向PCR加入dntp,0.5,ul,3 加入primer,0.5,ul,4 加入模板,0.5ul,5 加酶,0.5ul,6 加水,20.5ul,，至总体积为,25,微升？,按紧盖子，轻轻混匀，放入PCR仪 如何加样才能加得准？,5,反应条件,942-5分钟,94 40sec,5,7,40sec,72 1min 30sec,72 10min,30-35cycle,电泳缓冲液的配制,50TAE Buffer 配制方法：,1 称量Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g 于1L烧杯中；,2 向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀；,3 加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；,4。用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存。,使用时稀释50倍 即1TAE Buffer,1.5%,电泳,按照5份PCR产物与一份6loadingbuffer混合，取10-15ul混合液加入胶中，其中一孔加一份Marker对照，电泳，电压120，电泳半个小时，放入EB染色液中，染色半个小时，。,PCR,技术简介,PCR,常见问题：,一,.,出现假阴性；,二,.,出现假阳性；,三,.,出现非特异性扩增带；,四,.,出现片状拖带或涂抹带。,PCR,技术简介,一,.PCR,出现假阴性原因：,1,模板因素：,2,酶失活：,3,引物：,4,Mg,2+,浓度：,5,反应体积的改变：,6,物理原因：,7,靶序列变异：,PCR,出现假阴性原因分析及解决方案,模板因素：,（,1,）模板中含有杂蛋白；,（,2,）模板中含有,Taq,酶抑制剂；,（,3,）模板中蛋白质残留，,特别是染色体中的组蛋 白残留；,（,4,）提取制备模板时丢失过多；,（,5,）模板核酸变性不彻底。,PCR,出现假阴性原因分析及解决方案,模板因素引起假阴性解决方案：,1.,配制有效而稳定的消化处理液,;,2.,提取程序固定,不宜随意改动；,3.,模板,DNA,的溶解液应固定不变。,PCR,出现假阴性原因分析及解决方案,酶失活：,1.,酶本身的质量问题,(,供应商的问题）；,2.,酶存放时间太长；,3.,酶存放方式不当，或其他意外原因；,4.,忘记添加,Taq,酶。,PCR,出现假阴性原因分析及解决方案,酶失活引起假阴性解决方案：,1.,检查加样程序及过程，看是否忘记加,Taq,酶；,2.,更换新的,Taq,酶,;,3.,新旧两种,Taq,酶同时使用。,PCR,出现假阴性原因分析及解决方案,引物：,1.,引物质量；,2.,引物浓度；,3.,两条引物的浓度是否对称等。,PCR,出现假阴性原因分析及解决方案,引物引起假阴性解决方案,:,1.,选定一个好的引物合成单位,;,2.,引物浓度不仅要看,OD,值，稀释时更要平衡其摩尔浓度；,3.,引物应高浓度小量分装保存，防止反复冻融或长期冷冻保存，导致引物的变质降解失效，也可要求合成单位将固体分装；,4.,引物设计不合理，如长度不够，引物本身或两条引物之间形成二聚体等。,PCR,出现假阴性原因分析及解决方案,Mg,2+,浓度：,Mg,2+,浓度对,PCR,扩增效率影响极大，浓度过高可降低,PCR,扩增的特异性；浓度过低则影响,PCR,扩增产量甚至使,PCR,扩增失败，出现假阴性。,PCR,出现假阴性原因分析及解决方案,Mg,2+,浓度引起假阴性解决方案：,设置一组反应，其中每一反应中的其他离子浓度相同（如,Tris.Cl,KCl,等），而,MgCl,2,浓度不同（由,0.56mmol/L,每次增加,0.5mmol/L),，由此来摸索最佳,Mg,2+,浓度。,PCR,出现假阴性原因分析及解决方案,反应体积的改变：,做小体积,PCR,后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，而非简单地将反应体系中的各个成分加大几倍，否则易失败。,PCR,出现假阴性原因分析及解决方案,物理原因：,1.,变性温度低，变性时间短；,2.,退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低,PCR,扩增效率；,3.,延伸时间过短等。,PCR,出现假阴性原因分析及解决方案,物理原因引起假阴性解决方案：,1.,提高变性温度，延长变性时间，特别是首次循环，必要时可设为,95,，,10min,，或,PCR,反应以前在开水中煮沸几分钟。,2.,退火温度应根据,Tm,值来设定，也可首先将退火温度设为,45,，然后再逐次提高（以,2,/,次为宜）。,3.,延伸温度以,1000bp/min,足够，必要时也可适当延长，特别是末次循环，一定要延伸,10min,。,PCR,出现假阴性原因分析及解决方案,靶序列变异：,靶序列变异导致假引性的情况常常发生在靶序列变异正好发生于特异性引物与之结合部的中间，使引物失效。,解决方案：,根据已知序列重新选择区段设计引物。,PCR,技术简介,二,.PCR,出现假阳性原因：,1.,引物设计不合适；,2.,靶序列或扩增产物的交叉污染。,（,1,）整个基因组或大片段的污染；,（,2,）空气中的小片断核酸污染。,PCR,出现假阳性原因分析及解决方案,引物设计不合适：,1.,选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，从而扩增出非目的性序列的,PCR,产物。,2.,靶序列太短或引物太短导致特异性不强。,解决方案：,选择特异性强的区段设计引物。,PCR,出现假阳性原因分析及解决方案,整个基因组或大片段的污染的解决方案：,1.,操作时小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管污染环境。,2.,除酶及不耐热物品外，所有试剂及耗材均应高温高压消毒，所用离心管及枪头均应一次性使用。,3.,必要时，加样本前，反应管及试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。,PCR,出现假阳性原因分析及解决方案,空气中的小片断核酸污染：,这些小片断比靶序列短，但有一定同源性，可互相拼接，与引物互补后，扩增出,PCR,产物，导致假阳性出现。,解决方案：,运用巢式,PCR,来减轻或消除。,PCR,技术简介,三,.,出现非特异扩增带原因：,1.,引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体；,2.Mg2+,浓度过高，退火温度过低，,PCR,循环次数过多；,3.,酶的质量不过关，或加,Taq,酶的量过多。,PCR,技术简介,PCR,出现非特异扩增带解决方案：,1.,必要时重新设计合成引物；,2.,减低酶量或调换另一来源的酶；,3.,降低引物量，适当增加模板量，减小循环次数；,4.,适当提高退火温度或采用二温度点法（,94,变性，,65,左右退火与延伸）