,TOSOH BIOSCIENCE GmbH,Klicken Sie,um das Format des Titeltextes zu bearbeiten,Klicken Sie,um die Formate des Gliederungstextes zu bearbeiten,Zweite Gliederungsebene,Dritte Gliederungsebene,Vierte Gliederungsebene,Fnfte Gliederungsebene,Sechste Gliederungsebene,Siebente Gliederungsebene,Achte Gliederungsebene,Neunte Gliederungsebene,A.Sprauer 5/06,T,OYOPEARL,树脂填料,大小型工业制备色谱柱的装填实践,Gtec,Pall,GE Healthcare,Pall-Euroflow/Resolute,TOYOPEARL,树脂填料的装填,装填前的准备工作,小颗粒的去除,缓冲液平衡,匀浆准备,装填步骤,/,层析柱类型,层析柱的操作,柱子的平衡与柱效评价,保存,内容提要,Peak Biotech,装填的一般原那么,TOYOPEARL的装填压力最好在0.5-5 bar的范围内,装填流速至少比实际操作流速高50%,不要使用会产生剪切力的装置如：磁力搅拌器、齿轮泵 -这些装置会磨碎树脂填料并产生小颗粒,TOYOPEARL是一种刚性强的树脂填料，装填时务必区别于一般的软式琼脂糖凝胶,Superformance/Gtec,TOYOPEARL,树脂填料的装填,根本步骤,去除小颗粒,装填缓冲液平衡,匀浆准备,装柱,TOYOPEARL出货时为悬浮液状态含20%乙醇,TOYOPEARL,树脂填料的装填,装柱前务必进行小颗粒去除的操作,!,小颗粒的存在会阻塞筛板或烧结板，并最终会导致整个柱子的压降增大,小颗粒的去除采取悬浮静置移注法,重复这一步骤不少于,3,次,借助显微镜可检查小颗粒的存在,小颗粒的去除,TOYOPEARL,粒径,Coarse C,级规格,:100 m,Medium M,级规格,:65 m,Fine F,级规格,:45 m,Superfine S,级规格,:35 m,水中静置时间,15-30 Min.,30-45 Min.,45-60 Min.,60-90 Min.,Amicon Moduline-120cm ID,显微镜微观显示,Toyopearl 650 M,TOYOPEARL,的静置时间,在去除小颗粒时的最后一次步骤中可参加装填缓冲液进行填料的平衡,最好根据实际生产中所使用的缓冲液选取适宜的装填缓冲溶液,一般来讲，别离纯化工艺中将使用到的最高离子强度的流动相是装填缓冲液的首选,这一操作可以将填料装得最为紧密，并且可以防止死体积的发生或胶体内沟槽的出现。,装填缓冲液的平衡,TOYOPEARL-,典型的装填缓冲溶液,利用量筒测量静置胶体体积或使用水泵抽滤浆液至湿滤饼后计算装填所需要的填料体积,通过添加装填缓冲液调节浆液浓度,:,流动式装填柱,40-70%(v/v),自动装填柱,20-60%(v/v),最终装填好的柱床体积是要小于装填前胶体静置体积或抽干的湿滤饼的体积,Slurry preparation in the column,Slurry preparation in a separate tank,Settling resin,Amicon Moduline-120cm ID,匀浆准备,Toyopearl,HW-40,HW-50,HW-55,HW-65 and HW-75F,Ether-650,Phenyl-650,Butyl-650,DEAE-650,Super-Q-650,CM-650,SP-650 and all Affinity,QAE-550C and SP-550C,使用约,1.1,倍柱体积的静置胶,使用约,1.2,倍柱体积的静置胶,使用约倍柱体积的静置胶,对于给定的柱子，装柱所需的静置胶体积,恒流速装填法,恒压装填法,辅助的重力沉降装填法,不同装填方法的特点,装填方法 恒流速,恒压,重力沉降,装填速度,快快 慢,流速范围 可增大至较高 可增大至较高 只能慢操作,重复性 很好,很好 好,泵恒速 恒压,蠕动泵,压力计 需要需要 不需要,主要装填方法,方法简介:,将柱底筛板用装填缓冲液润湿赶走气泡,任何时候，均需确保浆液在注入层析柱前进行过匀浆操作,匀浆液倒入后，立刻将分配器置于储槽内浆液外表,分配器与溶液浆液间不应有气泡存在,阶段性调整装填流速至目标流速，以产生一个实时的、没有太大振动的栓塞流,在最初的压实操作根底上，为进一步压实柱床，至少泵入5-10倍柱体积的装填缓冲液,调整分配器至胶体外表,重复后两个步骤，直至柱床被彻底压实。最后将分配器移至距离柱床2-5 mm 处最后一次。不要担忧使用分配器的同时进行柱床的压实操作！,Millipore,Quik Scale,Flow Packed Columns,(Millipore-QuikScale+Moduline,GE Healthcare-BPG,Gtec-Superformance,BioRad-Geltec,etc.),恒流速装填方法,模式,填料类型,柱尺寸,cm ID x L,填料等级,装填流速,cm/h,操作流速,cm/h,SEC,HW-40,HW-50,HW-55,HW-65,HW-75,2,2 x 60,2,2 x 60,2,2 x 60,2,2 x 60,2,2 x 60,S(30 um),F(45 um),C(75 um),S(30 um),F(45 um),S(30 um),F(45 um),S(30 um),F(45 um),F(45 um),30 40,60 80,120 160,25 35,50 70,25 35,50 70,20 75,40 150,40 150,10 25,25 50,50 100,10 20,25 35,10 20,25 35,10 15,15 30,15 30,IEC,DEAE-650,SuperQ-650,CM-650,SP-650,SP-550,QAE-550,MegaCap II,SP-550,2,2 x 20,2,2 x 20,2,2 x 20,S(35 um),M(65 um),C(100 um),C(100 um),EC(100-300 um),400 600,800 1000,800 1200,700 1000,800 1200,45 65,80 130,80 600,80 240,80 500,HIC,Ether-650,Phenyl-650,Butyl-650,PPG-600,Butyl-600,SuperButy-550,Hexyl-550,2,2 x 20,2,2 x 20,2,2 x 20,S(35 um),M(65 um),C(100 um),M(65 um),C(100 um),400 600,800 1000,800 1200,800 1000,800 1200,45 65,80 130,80 500,80 130,80 500,AFC,AF-Amino-650,AF-Carboxy-650,AF-Formyl-650,AF-Epoxy-650,AF-Tresyl-650,AF-Chelate-650,AF-Blue HC-650,AF-Heparin-HC-650,AF-Red-650,2,2 x 10,M(65 um),800 1000,30 130,实验室规模最优化的装填及柱操作流速,柱尺寸,(I.D.x L),2.2 cm x 60 cm,9 cm x 30 cm,25 cm x 30 cm,填料类型,HW-55S,QAE-550C,DEAE-650M,目标流速,(ml/min),2,300,2000,增加量,(ml/min),0.5,50,500,保持时间,(min),0.5,2,2,恒流速装填法中流速的增加量举例：,恒流速装填方法,Gtec/Superformance 20cm ID Column,气泡会由于切换阀、管路连接处、,活塞运动、未脱气缓冲液而引起,.,恒流速装填方法-扰动由入口处筛板下气泡而引起的,装填,运行,管路清洗,卸料,Horizontal Flow-“Self Packer-preset column volume,(Pall/Euroflow-ResoluteTM,Millipore-IsoPakTM,GE Healthcare-Chromaflow,Eastern River),优点：易于装填,弱点：填料用量较大,卸料可能较难,有剪切力发生,卸料会导致大量的浆液体积,Resolute,恒压装填方法,Radial Flow-“Self Packer-preset column volume(Proxcys-CRIO),Low space requirements only 0,51 m2;even 600 liter BV is mounted on wheels,Large inlet surface area cotrolled&gentle product application(“Natural Distribution).,Thin frit keeps the resin together it is not used as flow distributor a barrier of only 60um negligible influence on pressure generation,Identical pathlength,for all substances A-E,CRIO 601S,5 liter BV,CRIO,-,C,olonne,R,adiale,I,n,O,xidable,恒压装填方法,Dynamic Axial Compression,(Novasep,Peak Biotech,Technikrom,GE Healthcare),Unpacking,Pneumatic/Hydraulic,Slurry transfer,优点：装填操作简单，非常快,缺点：卸料会导致大量的浆液体积,(while column is assembled),；不易操作,g(while disassembling the column),卸料缓慢,Peak Biotech/Dan Process,-DAC,恒压或恒流速装填方法,不要使用没有进行正确柱效评价的层析柱,!,SEC,、,RPC,及,HIC,型层析柱的柱效与装填质量密切相关的。,只有,IEC,和,AFC,型层析柱，在没有高塔板数时也能正常工作。尽管如此，对称性因子还是相当重要的。,层析柱操作,使用5-10倍柱体积的低离子强度缓冲液进行柱子的平衡,使用低分子量、无保存的化合物进行柱效的测定如：丙酮、盐,进样体积为柱体积的0.25-1%,将测定而得的塔板数、不对称性因子与厂家提供的最小值相比较,如果未到达最小塔板数等期望值，必须重新进行柱子的装填！,可供选择的方法:使用高离子强度的装填缓冲液，使用低盐溶液或水进样，会产生一个负的电导信号/倒峰不需要平衡、节省时间等,柱效评价,N=plates per column,V,e,=elution volume cm or ml,W,1/2,=width of the peak at,half peak height cm or ml,Symmetry:,Distance b/a=peak width,at 10%peak height,cm or ml,Injection,a,b,1/10 h,h,h,V,e,1/2 h,W,1/2,N=5.54(V,e,/W,1/2,),2,结果与以下因素有关:,评价操作因人而异,进样的可重复性硬件影响,流速,进样样品的分子尺寸,柱效与不对称性因子的