Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,组织化学技术(jsh),第一页，共36页。,以细胞学和组织学为基础，运用化学、物理、免疫(miny)和分子生物学的原理与技术，显示组织细胞内某种化学成分、化学反应及其变化规律，并进行定位和半定量研究的科学。,现代组织化学和细胞化学是介于细胞生物学、组织形态学、生物化学和分子生物学之间的一门边缘学科。,一、组织化学和细胞(xbo)化学的概念,第二页，共36页。,双蒸馏水 200ml,通过呈色反应显示组织细胞内的化学物质，反应的强弱代表化学物质含量的多少。,结果(ji gu)DNA呈紫红色,染色方法(fngf),不用水溶性固定剂，一般(ybn)选用AF固定液。,酸性磷酸酶 硫化胺,琥珀酸脱氢酶存在于所有(suyu)有氧呼吸的细胞，其中以心肌、肾小管曲部上皮细胞及肝细胞含量最丰富，它牢固结合于线粒体膜内，最适PH值为7.,染色方法(fngf),激活剂：镁、钙和锰等二价阳离子可提高酶活性。,双蒸馏水 200ml,是光学显微镜组织化学、细胞化学基础上的延伸与发展，实际上也就是(jish)普通细胞化学技术在电镜水平上的发展和应用。,I 酸性(sun xn)磷酸酶（Acid Phosphatase,ACP）,棕色瓶内装好，封口，放入冰箱中保存待用。,Normal ATPase in skeletal muscle,通过呈色反应显示组织细胞内的化学物质，反应的强弱代表化学物质含量的多少。,Feulgen-Rossenbeck改良的DNA法：,二、组织化学(huxu)和细胞化学(huxu)的分类,光镜组织化学:,通过呈色反应显示组织细胞内的化学物质，反应的强弱代表化学物质含量的多少。,电镜细胞化学（Electron Microscopy Cytochemistry）：,是光学显微镜组织化学、细胞化学基础上的延伸与发展，实际上也就是(jish)普通细胞化学技术在电镜水平上的发展和应用。电镜细胞化学主要用于研究细胞内各种成分在,细胞超微结构水平的分布状态，阐明各种细胞成分在生理、病理情况下与细胞结构和功能等之间的关系。,第三页，共36页。,电镜细胞化学与光镜组织、细胞化学的区别在于：,光镜细胞化学是利用特定的化学显色反应，将要研究的细胞成分以显色的方式在细胞原位凸现出来；,电镜细胞化学则利用特定的化学反应，形成(xngchng)高电子密度、不溶性的反应产物沉淀在细胞原位，借助电子显微镜进行超微结构的原位分析。,第四页，共36页。,酶类,有机物质，如糖类、脂肪、核酸,无机(wj)物质，如矿物盐类。,三、组织化学(huxu)和细胞化学(huxu)的研究对象,第五页，共36页。,多 糖 类,凡化学结构上含有(hn yu)糖分子的物质都称多糖类。多糖类物质分布很广，其中主要的有糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白和糖脂类。在机体内很多组织，如肝、肌肉、消化道、呼吸道和唾液腺的上皮粘液、甲状腺滤泡胶质和中枢神经系统等都含有(hn yu)糖。,最常用于显示多糖类的方法有：,过碘酸-Schiff反应,PAS阿尔辛蓝法,第六页，共36页。,过碘酸-Schiff反应（PAS）,作用原理,试剂配制,染色方法(fngf),结果,注意事项,第七页，共36页。,作用原理 通过过碘酸的氧化作用，将糖分子中的碳键打断，游离出醛基，与无色碱性品红反应显示(xinsh)出红色。,第八页，共36页。,试剂配制,过碘酸氧化液：高碘酸0.5g，蒸馏水100ml。,此液溶配后冰箱中待用。,Schiff液：碱性复红 1g,1N盐酸 20ml,偏重亚硫酸钠 1g,双蒸馏水 200ml,先将200ml双蒸馏水煮沸，稍有火焰，加入1g碱性复红，再煮沸1min。冷却至50加入20ml1N盐酸，待35时加入2g偏重亚硫酸钠。室温中2h之后(zhhu)见稍带红色，5h之后(zhhu)变为无色液体。棕色瓶内装好，封口，放入冰箱中保存待用。,第九页，共36页。,染色方法（略）,组织(zzh)切片，脱蜡至水；蒸馏水洗；,入过碘酸氧化液1020min；,充分蒸馏水洗；,Schiff液染色10min,流水冲洗10min（着色较深颜色的切片可缩短时间）。,可用苏木素液染核35min；,0.5%盐酸乙醇分化；,无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。,第十页，共36页。,结果(ji gu)PAS反应阳性产物呈红色，细胞核蓝色。,PAS反应显示小肠(xiochng)杯状细胞顶端的糖原颗粒,第十一页，共36页。,PAS反应显示(xinsh)肝细胞内的糖原颗粒,第十二页，共36页。,PAS反应显示肝细胞内的糖原(tn yun)颗粒,第十三页，共36页。,Normal human skeletal muscle cross-section of fibers.The dark fibers are type II or fast fibers and the light fibers are type I or slow fibers,PAS stain.LM X40.,第十四页，共36页。,Simple columnar epithelium,stomach,human,(PAS).,第十五页，共36页。,Cardiac muscles,(PAS).,第十六页，共36页。,注意事项,不用水溶性固定剂，一般(ybn)选用AF固定液。,偏重亚硫酸钠需质量优良，最好新开封的。,染了Schiff液后，不可用自来水冲洗过久，防止返红。切片变红适中后立即封片。,第十七页，共36页。,Alcian blue stain:,酸性(sun xn)多糖染成蓝色，核染成红色,第十八页，共36页。,Alcian blue PAS stain:,酸性多糖染成蓝色，中性(zhngxng)多糖染成红色,第十九页，共36页。,酶 类,一、酶的常用组织化学反应法,偶氮染料(u dn rn lio)法,吲哚酚法,金属金属盐法,氧化还原法,色素形成法,二、影响酶作用的因素,1.温度：37，超过56酶活性破坏,2.pH值：最适pH值均近于(jn y)中性。,3.酶反应速度受酶含量、底物量和反应产物量的影响。,4.抑制剂：酸和固定液可抑制所有酶的活性。,5.激活剂：镁、钙和锰等二价阳离子可提高酶活性。,第二十页，共36页。,I 酸性(sun xn)磷酸酶（Acid Phosphatase,ACP）,广泛分布于机体组织中，它主要位于溶酶体中，也有少量在内质网中。巨噬细胞、前列腺、空肠上皮纹状缘、肝、脾、肾及肾上腺等尤为丰富。,第二十一页，共36页。,酸性磷酸酶改良磷酸铅法作用原理,在酸性PH值的情况下，给切片加入甘油磷酸酯（或任何磷酸单酯），如有酸性磷酸酶，则释放磷酸酯，后者与高浓度的Pb2+结合，形成无色(w s)的磷酸铅，经硫化胺（或硫化氢）作用，磷酸铅转变为黑色硫化铅：,酸性磷酸酶 硫化胺,甘油磷酸酯 磷酸酯+铅 磷酸铅 硫化铅,第二十二页，共36页。,结果(ji gu)硫化铅沉淀为黑色或棕色的沉淀,输卵管峡部粘膜(zhn m)上皮细胞内酸性磷酸酶活性部位,第二十三页，共36页。,II 碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）,常见于具有活跃转运功能(gngnng)的细胞膜内，如毛细血管及小动脉的内皮，肝内胆小管膜，肾近曲小管的刷状缘，肾上腺、膀胱、脾脏内皮细胞以及乳腺和卵巢中。,第二十四页，共36页。,碱性(jin xn)磷酸酶的钙钴法作用原理,在pH9.4及Ca2+存在的情况下，给切片加入甘油磷酸酯（或任何磷酸单酯），如有碱性(jin xn)磷酸酶，则释放磷酸酯，后者与高浓度的Ca2+结合，形成无色的磷酸钙，经硝酸钴处理后，磷酸钙转变磷酸钴，再经硫化胺作用，磷酸钴转变为黑色硫化钴：,碱性磷酸酶,+Ca,2+,+Co,2+,甘油磷酸酯 磷酸酯 磷酸钙 磷酸钴,硫化钴（黑色）,硫化胺,第二十五页，共36页。,结果(ji gu)硫化钴的黑色沉淀表示酶活性。,肾小管内的碱性(jin xn)磷酸酶活性部位呈黑色 钙-钴法,第二十六页，共36页。,III 琥珀酸脱氢酶（SDH）,属于琥珀酸氧化酶系统,是三羧酸循环中一个很重要的酶。琥珀酸脱氢酶存在于所有(suyu)有氧呼吸的细胞，其中以心肌、肾小管曲部上皮细胞及肝细胞含量最丰富，它牢固结合于线粒体膜内，最适PH值为7.6。此酶对固定剂很敏感，因此，要求新鲜组织冰冻切片。,第二十七页，共36页。,输卵管壶腹部(f b)粘膜上皮细胞内琥珀酸脱氢酶活性部位,硝基蓝四唑法或二甲亚砜法结果(ji gu)：酶活性表现为蓝紫色,第二十八页，共36页。,Normal ATPase in skeletal muscle,Abnormal ATPase in skeletal muscle,第二十九页，共36页。,脂 类,脂类包括脂肪和类脂。根据其性质可以分为中性(zhngxng)脂肪、脂肪酸、胆固醇、磷脂等。,脂肪不溶于水，只溶于有机溶剂如浓乙醇、乙醚、氯仿、二甲苯、苯等，因此需要选择不含有机溶剂的固定液。脂肪组织的切片一般用冰冻切片或碳蜡包埋切片。,病理状态下，实质性的脏器如心、肝、肾等组织细胞发生脂肪变性；动脉粥样硬化、脂肪栓塞、脂肪组织来源的肿瘤等均可用脂类显示方法加以鉴别。,第三十页，共36页。,脂肪染色法有多种，常用的有：,苏丹(sdn)染色法,苏丹(sdn)染色,油红染色法,第三十一页，共36页。,苏丹 或染色法,作用原理 利用苏丹类染料在脂肪中的溶解度远大于在其有机溶剂中的溶解度，使其迅速(xn s)从有机溶剂中转移到脂质上，让脂质着色。,苏丹、染液的配制：Sudan 或 0.5g，70酒精 50ml，丙酮 50ml。,染色方法（略）,第三十二页，共36页。,结果 Sudan 中性(zhngxng)脂肪为橙红色；,Sudan 中性(zhngxng)脂肪呈猩红色，细胞核呈蓝色。,第三十三页，共36页。,核 酸,核酸的染色已经广泛用于淋巴系统、脾脏(pzng)、骨髓以及其他脏器疾病的诊断和研究，如一些免疫系统的疾病，过敏反应以及一些免疫系统的肿瘤等。,常用染色方法：,Feulgen-Rossenbeck改良的DNA法,Cook甲基绿-派洛宁法,第三十四页，共36页。,Feulgen-Rossenbeck改良的DNA法：,作用原理 脱氧核糖核酸通过盐酸水解，首先(shuxin)从DNA的脱氧核糖核酸残基分解出碱基；然后在脱氧核糖残基的第14位碳键处打断糖苷键而游离出醛基，游离出来的醛基即与无色复红液（Schiff试剂）反应形成紫红色的复合物而把DNA显示出来。,Schiff试剂配制 同PAS反应,第三十五页，共36页。,结果(ji gu)DNA呈紫红色,第三十六页，共36页。,