单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定,1,.,生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定1.,生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定,三个关键问题,:,目标蛋白分子病理条件下的序列变化（测序）,避免目标蛋白分子的技术性降解（,-70,C,条件下保存，实验操作通常在冰浴下进行，与此同时要,加全蛋白酶抑制剂）,结合实验目的，选择合适的分析方法（定性与定量，相对定量与绝对定量）,2,.,生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定三个关键问题:2.,生物系统中总蛋白质的定量,凯式（,Kjedahl,）定氮法,光吸收法,双缩脲法,福林,-,酚法,考马氏亮兰,G-250,法,氨基酸分析法,BCA,法,3,.,生物系统中总蛋白质的定量3.,凯式（,Kjedahl,）定氮法,最早的经典方法。,各种蛋白质的含氮量相对恒定，,14,16,。,计算公式：蛋白质量,=,含氮量,/16%=6.25,含氮量。,实验步骤如下：,注意事项,:,本法非常灵敏，务必避免外界氨的干扰。,一定量蛋白质,硫酸铵溶液,氨气,蛋白质含氮量,蛋白质含量,(NH,4,),3,BO,3,浓硫酸,NaOH,蒸馏,H,3,BO,3,HCl,滴定,指示剂,4,.,凯式（Kjedahl）定氮法一定量蛋白质硫酸铵溶液氨气蛋白质,光吸收法,因为芳香族氨基酸,Tryptophan,和,Tyrosine,的存在，使得,Proteins,溶液在,280nm,呈现特征性吸收峰。以此来定量溶液中的,Proteins,。,一个经验公式：当,Proteins,溶液,A,280,=1,时，溶液中,Proteins,的浓度,=1mg/ml,。,各种,Protein,所含芳香族,Amino acid,的含量是不同的，有时会有较大差异，因此光吸收法是一种较粗略的蛋白质定量方法。,有时,Proteins,样品中有,Nucleic acids,存在，,Nucleic acids,也有紫外吸收，因此会对,Proteins,的测定产生干扰。这时采取分别测定,280nm,和,260nm,光吸收值，并以下式计算。,蛋白质浓度（,mg/ml,）,1.45A,280,0.74A,260,。,5,.,光吸收法5.,光吸收法,(continue),最准确的办法是，首先得到,Target Protein,在,280nm,的吸光系数,，其次针对性地测定该,Target Protein,溶液的,280nm,吸光度值，最后再利用公式计算溶液中,Target Protein,的浓度（,C=A280/,L,L,：比色杯内径,cm,）。,测定,Target Protein,在,280nm,的吸光系数，必须首先得到干燥的该,Target Protein,纯品。在,105C,下恒重后，精确称量,110mg,，再定量溶于一定体积的蒸馏水中，通常浓度为,1mg/ml,，测定溶液,280nm,光吸收，计算得到吸光系数,。,6,.,光吸收法(continue)6.,双缩脲法,基于蛋白质链肽键“,CO,NH,”有双缩脲反应特性即，,Proteins,在碱性溶液中与,Cu,2,发生络合反应显蓝色。,受,Proteins,特异性影响较小。,适用于较大量,Proteins,（,mg,）的定量测定。,实验操作简便。,7,.,双缩脲法7.,福林,-,酚法,灵敏度和准确度均较高。,实验操作较繁琐。,影响因素较多，如去垢剂等。,8,.,福林-酚法8.,考马氏亮兰,G-250,法,实验操作简便。,适合于定量,10100,g,的,Proteins,。,应用广泛。,测定,Proteins,的考马氏亮兰,G-250,溶液也叫作“,home-made”,试剂。,9,.,考马氏亮兰G-250法9.,氨基酸分析法,通过把,Proteins,水解成,Amino acid,，然后再对,Amino acid,进行分析来定量,Proteins,。,很准确，最接近于真实值。,测定值比实际量有时会偏低。主要原因是,Protein,水解时，,Trp,被完全破坏，,Cys,也要遭受很大损失，,Ser,和,Thr,的回收也只有,90,。,一种新的测定蛋白质的方法：,BCA,法,10,.,氨基酸分析法10.,BCA,法,一种新的测定,Proteins,的方法,灵敏度和重复性均佳。,干扰因素少。,试剂公司（,Pierce,）有试剂盒供应。,11,.,BCA法11.,生物系统中某种,Target Protein,的定量,ELISA,（,Enzyme Linked ImmunoSorbent Array,）,Western blotting,Enzyme activity,测定,12,.,生物系统中某种Target Protein的定量12.,夹心法（,sandwich method,）,Antigen,Antibody-1,Antibody-2,ELISA,（,Enzyme Linked ImmunoSorbent Array,）,13,.,夹心法（sandwich method）AntigenAnt,讨论题一：,某实验室欲建立一种双抗体夹心法，以检测人血清中蛋白,A,的含量。以往该实验室曾自己制备了一兔抗人蛋白,A,多克隆抗体，并从某公司购买了一鼠抗人蛋白,A,单克隆抗体。该实验室按如下方案进行预实验，结果失败了。请分析最可能的原因是,。,Antigen,，人蛋白,A,Polyclonal antibody,monoclonal Antibody,14,.,讨论题一：Antigen，人蛋白APolyclonal an,讨论题二：,上述实验室不甘心失败，仔细分析后找到了失败的原因。为了达到实验目的，他们调整实验方案如下，进行预实验，结果又失败了。请分析最可能的原因是,。,Antigen,，人蛋白,A,Polyclonal antibody,Monoclonal Antibody,15,.,讨论题二：Antigen，人蛋白APolyclonal an,讨论题三：,.,。,讨论题,X,：,.,。,16,.,讨论题三：16.,MMP-9,MMP-2,M 1 2 3 4,kD,212,170,116,76,53,600,500,400,300,200,100,542.6,25.0,1 2 3 4,300,250,200,150,100,50,251.4,3.8,0.0,100.0,MMP-9,相,对,密,度,单,位,1 2 3 4,100.0,0.0,MMP-2,相,对,密,度,单,位,M.,蛋白,marker,1.,培养液空白对照，,2.,食管癌细胞,SHEEC,对照,3.,有义促进,NGAL,基因表达的食管癌细胞,SHHEC,4.,反义封闭,NGAL,基因表达的食管癌细胞,SHHEC,细胞培养上清液中,MMP-9,和,MMP-2,活性的检测结果,17,.,MMP-9MMP-2M 1 2 3,Target Protein,的鉴定,Protein,测序：,1,）,N-end,测序，,2,）,C-end,测序，,3,）质谱测序。,pI,测定,HPLC,分析。,SDS-PAGE,电泳分析。,CE,分析。,肽谱分析（,Fingerprinting,）。,MALDI-TOF-MS,。,18,.,Target Protein的鉴定18.,Target Protein,的鉴定,巯基的鉴定。,糖基修饰的鉴定。,磷酸基修饰的鉴定。,甲基修饰的鉴定。,酰基修饰的鉴定。,酰胺基的鉴定。,X-ray,衍射分析,Target Protein,晶体结构。,19,.,Target Protein的鉴定19.,谢谢！,20,谢谢！20,