单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2018/12/31 Monday,#,DNA,甲基化与临床应用,目录,甲基化的作用,2,临床相关应用,4,引言及概念,3,1,甲基化检测相关技术,3,3,为什么,熊猫,是,黑白,的？,基因决定命运,同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组。但他们长大成人后在性格,、,健康方面往往存在很大差异。,先从表观遗传学谈起,相同的基因型,不同的表型,?,基因,环境,表型,表观遗传学,现代表观遗传学,概念：,基因的,DNA,序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生,可遗传,的表型。,表观遗传学的现象（基因表达的调控方式）：,DNA,甲基化,-,表观遗传学的核心（最初始的调控方式）,组蛋白修饰,MicroRNA,Genomic imprinting,不同层次表达调控,DNA,甲基转移酶,：,DNMT,胞嘧啶：,Cytosine,5-,甲基胞嘧啶,：,5-Methylctosine,S-,腺苷,-,甲硫氨酸,：,SAM,S-,腺苷,-,高半胱氨酸,：,SAH,DNA,甲基化,是指在,DNA,甲基化转移酶,的作用下，在基因组,CpG,二核苷酸的,胞嘧啶,5,碳位以共价键结合一个,甲基,基团。,DNA,甲基化的概念,DNA,甲基转移酶,(DNMT),哺乳动物体内有三种,DNA,甲基化转移酶：,DNMT1,、,DNMT3A,和,DNMT3B,。,DNMT1-,持续性,DNA,甲基转移酶；与甲基化相关，缺乏引起基因组低甲基化，染色体缺失、重排、突变畸形。,DNMT3A,、,DNMT3B-,从头甲基转移酶；与去甲基化相关，在胚胎干细胞和早期胚胎中高度表达，缺乏引起胚胎死亡，在肿瘤组织中广泛高表达。,通常,启动子,和,第一个外显子区,，,CpG,序列密度非常高，超过均值,5,倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区。,结构基因组中,70%,90%,的独立,CpG,都被甲基化,未甲基化的,CpG,成簇地聚集形成,CpG,岛,约有,60,以上基因的启动子含有,CpG,岛。,是结构基因启动子的核心序列和转录起始点。,CpG,岛（,CpG island,）,预测软件,http:/pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.html,http:/www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/,目录,甲基化的作用,2,临床相关应用,4,引言及概念,3,1,甲基化检测相关技术,3,3,DNA,甲基化的生物学作用,在发育和分化中调控基因的表达,转录抑制,特征性表型基因的表达（肤色、毛发）,X,染色体的失活（,X-inactivation,）,基因印记,碱基突变,肿瘤代谢,DNA,甲基化作为一种可遗传的表观遗传修饰，在体细胞增殖过程中通过依赖于,DNA,复制的,DNA,甲基转移酶,Dnmt1,稳定地传递给子细胞。但在胚胎发育的不同时期，基因组范围内的,DNA,甲基化水平会发生剧烈的改变，改变最剧烈的阶段为,配子形成期,与,早期胚胎发育,阶段，甲基化模式在配子形成时已经建立。,DNA,甲基化与胚胎发育,DNA,甲基化在动物胚胎和生殖细胞发育过程中的重编程,CPG island,的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达,基因表达的调控开关,转录抑制,影响,基因表达,直接抑制基因表达或甲基化的,CpG,双核苷酸序列可被甲基结合蛋白家族 识别，而后者可通过吸引补充,组蛋白去乙酞化酶,和,组蛋白甲基化转移酶等组蛋白修饰蛋白质,来改变染色质的活性，以间接方式影响基因表达。,IAP:intracisternal A particle,去甲基化：灰鼠基因（,agouti,）仅微量表达,甲基化：基因超量表达,特征性表型基因的表达,X,染色体的失活,X,染色体的失活（,X-inactivation,）：生长发育过程中，雌性哺乳类动物细胞中的两条,X,染色体其中一条失去活性的现象。,研究发现失活的染色体上,DNA,序列都呈高度甲基化，导致绝大多数基因转录处于关闭状态。,避免因拥有两条,X,染色体而产生双倍,基因产物，保持和雄性动物,X,染色体,数量及功能上的一致性。,基因组印记？,组织或细胞中，基因的表达具有亲本选择性，即只有一个亲本的等位基因表达，而另一亲本的等位基因不表达或很少表达的现象，相应的基因则称为印记,基因。,父系不表达称父系印记,母系不表达称母系印记,基因印记,差异甲基化区域,差异甲基化区域,(differentially methylated region,，,DMR),，是指染色体上甲基化状态具有亲本特异性的区域，即来源于不同亲本的,DNA,序列甲基化状态不同的区域,差异甲基化主要发生在基因的启动子区，少数在外显子，现已发现的印记基因大多数具有,DMR,或受,DMR,调控。,碱基,C T,突变,碱基突变,甲基化 突变,肿瘤细胞发生时常出现,DNA,甲基化模式的变化，主要包括甲基化转移酶表达水平的提高、基因组整体甲基化水平的降低和,CpG,岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组不稳定，如染色质构象异常、转座子激活、原癌基因激活表达以及抑癌基因被抑制表达等。,DNA,甲基化与肿瘤,目录,甲基化的作用,2,临床相关应用,4,引言及概念,3,1,甲基化检测相关技术,3,3,A,基因组甲基化水平,(Methylation Content),的分析,高效液相色谱,高效毛细管电泳法,B,候选基因,(Candidate Gene),甲基化分析,甲基化敏感性限制性内切酶,-PCR/Southern,法,重亚硫酸盐测序法,甲基化特异性的,PCR,甲基化荧光法,(MethyLight),焦磷酸测序,结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法,甲基化检测相关技术,C.,基因组范围的,DNA,甲基化模式与甲基化谱分析,限制性标记基因组扫描,甲基化间区位点扩增,甲基化,CpG,岛扩增,差异甲基化杂交,由连接子介导,PCR,出的,HpaII,小片断富集分析,甲基化,DNA,免疫沉淀法,高效液相色谱法,直接测序法,焦磷酸测序法,通过检测,CpG,对应位点上,C/T,渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。,全基因组甲基化图谱,全基因组甲基化测序（,WGBS,）,芯片平台,Illumina,850K,芯片可检测人全基因组约,853,307,个,CpG,位点的甲基化状态。,850K,芯片不但保持了对,CpG,岛，基因启动子区的全面覆盖，还特别加强了增强子区以及基因编码区的探针覆盖。广泛应用于干细胞研究、肿瘤和其他复杂疾病研究，是目前最适合表观基因组全关联分析研究的全基因组,DNA,甲基化芯片。,Illumina,850K,芯片技术,流程,目录,甲基化的作用,2,临床相关应用,4,引言及概念,3,1,甲基化检测相关技术,3,3,正常生物,DNA,甲基化,DNA,甲基化始发于胚胎早期，随着组织细胞分化发育，基因组,DNA,经历了去甲基化、区域性的重新甲基化以及组织特异基因选择性的去甲基化的过程。最后，这种,DNA,甲基化模式就相对稳定下来。,肿瘤组织的,DNA,甲基化,肿瘤中普遍存在,DNA,甲基化状态的改变，其特点是总体的甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。,肿瘤细胞的特征：,癌基因 低甲基化 被激活,抑癌基因 高甲基化 被沉默,应用前景,1-,肿瘤的早期,诊断,抑癌基因发生异常甲基化是在肿瘤早期就发生而且一直进行的，导致恶性肿瘤表型的表达,优点：,DNA,甲基化检测具有早期、无创、快捷、灵敏度高等特点。（血液、粘膜上皮标本）,缺点：特异性不足,表观遗传学生物标记开发,2017,年,3,月，张鹍教授团队在,Nature Genetics,（,NG,）杂志发布了令人振奋的研究成果，利用更灵敏的算法配合组织甲基化模式开发的无创诊断技术，可以检测并定位肿瘤。通过比较肿瘤和正常细胞的,DNA,甲基化数据找到肿瘤特异的甲基化,Marker,。,燃石医学自主研发了无创甲基化检测系统,(MERMAID),，运用多层级甲基化探针设计策略，可实现在检测成本可控的情况下同时检测,超过,10,万个临床诊断相关的甲基化,CpG,位点,，并通过机器学习算法建立分类模型，实现对检测样本自动分型。,cfDNA,无创甲基化检测系统,(MERMAID),用于肺部占位病变（含肺癌）的早筛可实现,99.6%,的敏感性和,100%,的特异性，用于肺部结节良恶性判定可实,84.8%,的敏感性和,87.5%,的特异性。,cfDNA,甲基化液体活检技术,应用前景,2-,肿瘤复发的独立预测因子,口腔鳞状细胞癌时存在,RECK,基因甲基化的患者复发率明显增高,甲基化影响生存期,膀胱癌中,APC,、,GSTP1,和,TIG1,基因发生异常甲基化时，患者存活时间明显缩短,LONG N K,et al.Hypermethylation of the RECK gene predicts poor prognosis in oral squamous cell carcinomas J.Oral Oncol,2008,44(11):1 052-1 058.,ELL INGER J,et al.Hypermethylation of Cell-Free Serum DNA Indicates Worse Outcome in Patients With Bladder Cancer.J Urol,2008,179(1):346-352.,应用,前景,3-,肿瘤的去甲基化治疗,DNA,甲基化程度依赖于,DNMT,活性。正常甲基化模式的建立需要,DNMT1,和,DNMT3,的共同作用，,DNMT1,是,DNMT3,启动,CpG,核苷酸从头甲基化的保证，而,DNMT3,则使甲基化水平稳定在正常需要水平（去甲基化）,抑制,DNMT,活性药物是治疗肿瘤的新希望,优点：新型抗肿瘤药物,缺点：,无基因特异性,不能选择性地活化沉默的目的基因，从而会引起整体的低甲基化,;,药物的活化作用可逆，疗效依赖于药物的持续存在,;,大剂量应用时会对正常细胞有毒副作用,是否会诱发第二肿瘤？,应用,前景,3-,肿瘤的去甲基化治疗,