,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,RNA干扰,RNA干扰,RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链RNA引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:,TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;,PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。,简介,RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同,2,何为,RNA,干扰技术,RNA,干扰,( RNA Interference ,RNAi),是通过体外人工合成的或体内的双链,RNA( Dubble- stranded RNA,dsRNA),在细胞内特异性的降解其同源,mRNA,使相应的基因沉默,达到阻止基因表达的目的。,何为RNA干扰技术 RNA 干扰( RNA Interfer,3,Glossary (,术语,),RNAi- RNA interference(RNA,干扰,),siRNAs-Small interfering RNAs (,小干扰性,RNA),dsRNA-double strand RNA(,双链,RNA),RISC-RNA-induced silencing complex(RNA,诱导沉默复合物,),RdRP- RNA-directed RNA polymerase (RNA,指导,RNA,聚合酶,),Dicer- RNaseIIIrelated enzymes (RNaseIII,家族成员,),PTGS-Post-transcriptional gene silencing,转录后基因沉默,Glossary (术语)RNAi- RNA int,4,RNAi,发生过程,RNAi发生的基本过程可分为,起始阶段,和,效应阶段,。,在起始阶段,一种称为Dicer的酶，以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或由转基因、病毒感染、转座子的转录产物等各种方式引入的dsRNA，短的dsRNA继而形成有效复合物：RISC、RITS或miRNA。RNase的2个催化中心由2个单体酶组成，其核体以反向平行的排列方式与dsRNA结合形成4个活性中心。中间2个未被活化，使得作用中心有一定的距离，因此Dicer能将dsRNA比较均匀地切成2123nt大小的siRNA(shortsmall interference RNA)。Dicer的结构变化会引起siRNA长度的改变，这使得siRNA具有种族差异。,产生的siRNA有3大特点；长度为2123nt；末端有2nt未配对碱基；5末端磷酸化。,RNAi发生过程 RNAi发生的基本过程可分为起始阶段和,5,在效应阶段,，siRNA参与形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencing complex，RISC)。RISC以ATP依赖的方式催化双链siRNA解旋，然后利用其内部的单链siRNA，通过碱基配对识别与之互补的靶RNA，随后，RISC中的核酸内切酶在距离siRNA 3端12个碱基的位置切割靶RNA，最后，切割后的靶RNA在核酸外切酶的作用下被降解掉，导致目的基因的沉默。,在效应阶段，siRNA参与形成RNA诱导的沉默复合物(RNA,6,RNA干扰与应用精讲课件,7,目前研究比较清楚见使用较多的一种基因沉默小分子是siRNA，它分别在两种的水平上引导基因沉默，体现RNAi的作用。,(1)转录水平,(2)转录后水平,目前研究比较清楚见使用较多的一种基因沉默小分子是siRNA，,8,转录水平,RNA介导的DNA甲基化(RNAdirected DNA methylation，RdDM)被最早发现于类病毒感染的番茄中。dsRNA被降解成2123nt的小片段RNA时，这些小的RNA分子在细胞核可诱发同源序列的DNA甲基化。这种序列特异性的甲基化的信号与RNADNA结合有关。当dsRNA含有与启动子同源的序列，即可使同源靶启动子序列甲基化，从而使靶启动子失去功能，导致下游基因沉默。,转录水平 RNA介导的DNA甲基化(RNAdirected,9,RNA干扰与应用精讲课件,10,转录后水平,首先特异性的Dicer酶依赖ATP切割dsRNA，将其分解成具有2个核昔酸的3末端的小片段的双链s,i,RNA。其次RI,SC,识别并降解mRNA。RI,S,C是一种蛋白,R,NA效应器核酸酶复合物。双链siRNA为R,ISC,的重要组成部分，它依赖ATP解旋并导致RI,S,C活化，然后通过碱基互补配对识别底物mRNA与之结合，并自siRNA的3端将mRNA切割成小于12,nt,的片段使其降解。,转录后水平首先特异性的Dicer酶依赖ATP切割dsRNA，,11,RNA,干扰,所,涉及的技术,一般来说，任何克隆的基因都可能成为寡RNA的靶，不管该RNA是人工设汁的，还是RNA表达的病毒载体，只要其与靶基因转录的mRNA具有序列互补性即可。下面将RNAi主要涉及到的技术作一般的介绍。,干扰RNA(siRNA)及合成,RNAi质粒和病毒裁体的构建,转染方法,RNA干扰所涉及的技术 一般来说，任何克隆的基因都可能成,12,干扰RNA(siRNA)及合成,2023bp的双链siRNA是可以进行大量合成的，而且也很容易进行细胞的转染。,在一过程中,，,首先需要获得目的基因的cDNA序列，然后以cDNA为模板合成siBNA。,一般人们选择的区域是以靶基因转录物的AUG起始密码子下游50100bp处开始选择siRNA作用位点，而5和3非编码区和起始密码十附近区域应尽量避免,干扰RNA(siRNA)及合成 2023bp的双链siRN,13,双链siRNA的设计、合成是进行RNAi研究的关键,siRNA的体外转录可以直接制备双链的siRNA 。,这一方法所需要的条件是要拥有带噬菌体启动子的线性DNA模板以及相应的用于PCR 扩增所涉及到的试剂，这其中包括噬菌体RNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶。RNA聚合酶是体外转录合成siRNA的关键性酶，常用的RNA聚合酶有T7T3和SP6，它们都以DNA为模板，并要求有特异性的启动子序列。RNA聚合酶与双链的DNA启动子结合后，它将打开双链DNA模板合成互补于DNA的RNA链。 当然如果所用的模板是cDNA，可根据cDNA序列相对于启动子的方向设计正义、反义模板，即可合成出对应的正义、反义RNA链，经杂交可得双链RNA。,双链siRNA的设计、合成是进行RNAi研究的关键,14,RNAi质粒和病毒裁体的构建,在进行RNAi研究中什么要用到表达质粒和病毒载体呢?,其中一个,主要的原因是表达载体可以在细胞中持续产生siRNA以达长久抑制靶mRNA的目的。,另外,的原因是特定的病毒载体对特定的细胞非常有效，尤其是对后有丝分裂的细胞特别有效，能增加细胞的转染率。,第三个,原因是，就病毒载体本身而言，其可以在细胞中进行持续表达。,RNAi质粒和病毒裁体的构建在进行RNAi研究中什么要用到表,15,转染方法,传统的寡脱氧核糖核酸和DNA质粒导入细胞的方法己成功地用于siRNA导入细胞的研究，然而到目前为止还没有一种siRNAs的转染方法能适宜对所有细胞类型的转染，所以必须优化转染条件以便获得最理想的基因沉默。,通过研究发现细胞培养条件(包括细胞密度和培养基组成)；转染的试剂类型和量；siRNA的质与量以及siRNA处理细胞的时间长短等转染参数都影响着转染和基因沉默的效果。,转染方法传统的寡脱氧核糖核酸和DNA质粒导入细胞的方法己成功,16,为了增殖细胞subconfluent细胞密度是种极好的选择细胞密度最好是200500个mm,2,。,转染最好是么没有血清的培养基中进，因为血清中的蛋白质会与siRNAs粘合或降解siRNAs。,另外细胞的粘连与否对siRNAs的转染和靶基因的沉默是有影响的,为了增殖细胞subconfluent细胞密度是种极好的选择,17,在进行RISC(RNAinduced silencing complex)酶生物化学纯化的研究中，siRNA是RISC中最先得到的亚单位。通过对果蜗胚胎的溶解产物和S2细胞提取物中的RISC作进一步试管研究分析，在此基础之广，创建了分离纯化该类复合体，以及鉴定其组成的方法。RISC是一种核糖核蛋白复合体，是由核算内切酶、核酸外切酶、解旋酶等组成，RISC具有切割mRNA活件的复活体、切割发生在与siRNA同源的mRNA上，这样靶mRNA被切割降解，最终不能再翻译成相应的蛋白质。,RISC,：,RNAi的催化引擎,在进行RISC(RNAinduced silen,18,RNA诱导沉默复合体中的生物大分子及其装配,在,RNA干扰(RNAi)的过程中，RI,SC,的形成及其发挥作用的过程是,RN,A,i,的效应步骤。在,整,个,RN,A,i,的作用过程中，这一步是RNA发挥作用的最后阶段，同时也是最重要的阶段。RI,SC,是一种多蛋白质复合体，RISC由Dicer酶，Argonaute蛋白，siRNA等多种生物大分子装配而成,。,RNA诱导沉默复合体中的生物大分子及其装配,19,研究表明,，,RISC中的Dicer,具有RNase结构域，在RNAi的起始阶段负责催化siRNA的产生，在RISC装配过程中起稳定RISC中间体结构和功能的作用;,Argonaute蛋白,是RISC中的核心蛋白，有PAZ和PIWI两个主要的结构域，前者为siRNA的传递提供结合位点，后者是RISC中的酶切割活性中心;,siRNA,是RISC完成特异性切割作用的向导，在成熟的RISC中虽然只包含siRNA的一条链，但siRNA在RISC形成过程中的双链结构是保证RNAi效应的决定因素。,尽管RISC中还存在其他一些功能未知的蛋白质，但在RISC组分结构及功能研究方而取得的进展为建立一个可能的RISC装配模型提供了理论基础。,研究表明，,20,RISC中的生物大分子,Dicer酶,Argonaute蛋白家族,siRNA,其他大分子,RISC中的生物大分子Dicer酶,21,Dicer（DCR）,Dicer酶催化了RNA i过程中由双链RNA(double stranded RNA, dsRNA)切割成siRNA的反应，随后与siRNA及其他蛋白一同参与RISC装配的起始。Dicer的分子结构中常含有具催化活性的RNase结构域和双链RNA结合结构域(dsRNA binding domain, dsRBD)。研究表明，在真核细胞中存在多个功能不同的Dicer或Dicer类似蛋白(Dicer likeprotein, DCL)，它们在与 RNAi相关的不同途径或环节中分别或共同起作用。果蝇中的Dicer 1(DCR 1)负责催化miRNA前体的产生，Dicer 2(DCR 2)负责催化dsRNA切割成si RNA。拟南芥中的DCL1与DCL3分别与miRNA生物活性，催化产生重复序列和转座子siRNA及染色体沉默有关;而另外两种DCL( DCL2, DCL4)的功能未知。,Dicer（DCR）,22,Argonaute蛋白家族,Argonaute蛋白是RISC的核心组分,，Argonaute家族蛋白具有PAZ和PIWI两个主,要结构域。PAZ结构域高度保守，主要结构是一个由6条链构成的左手,桶(,1-3,，,6-8,)，在桶的一端连有2个,螺旋(,1,2,)，另一端连一个组件(,4,，,5,，,3,),，在俘桶与a俘组件之间形成一个口袋状的,结构,，恰好可以插入siRNA 3末端突出的两个碱基，因此，PAZ是RISC中siRNA的结合位点,。,Argonaute蛋白除了起结合siRNA的作用外，另外一个重要的功能是催化RISC对靶RNA的特异性切割。研究表明，这个切割作用是由PIWI结构域完成的。,Argonaute蛋白家族Argonaute蛋白是RISC的,23,siRNA(small interfering RNAs),：,小干扰RNA ，一种短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径（RNA interference pathway）。,其中有一个特异性的dsRNA核糖核酸酶家族RNase 家族与之密切相关，在实验研究中发现该类酶裂解产生的产物的特征与siRNAs极为相似。siRNA是RNAi复合体中的组成部分，可以通过果蝇胚胎溶解物中的dsRNA片段裂解成siRNA来获得小RNA。,siRNA(small interfering RNAs),24,其他大分子,RISC中还存在其他一些功能未知的组分,，大多数可以起到一个协同作用。但具体功能未知，还需要更深入的研究。,例如：其中在人体内已经找到了dFXR同源物FMRP，但功能未知;VIG是一种富含RGG的蛋白质，这与锥虫中TbAGO1的N末端很相似，它是否也同TbAG01的功能一样参与Argonaute蛋白的切割还不得而知;最近Scadden等发现Tudor SN可能同RNA腺普酸脱氨酶(adenosine deaminase that act on RNA, ADARs)对dsRNA的修饰过程共同起作用，协助RISC完成切割:首先，dsRNA在ADARs作用下将50%的腺普酸(A)变成次黄普酸(I)，而后，Tudor SN能够特异性地和高度富含IU, UI对的dsRNA结合，从而协助RISC完成切割作用。,其他大分子RISC中还存在其他一些功能未知的组分，大多数可以,25,RISC的装配,RISC的装配,26,装配的起始,RISC组分的有序组装,siRNA的解链,装配的起始,27,miRNA,miRNA是一类长度很短的非编码单链小分子RNA，约2024 nt，由一段具有发夹环结构的长度为7080 nt的单链RNA前体(pre-miRNA)剪切后生成。miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分定位于基因问隔区。其转录独立于其他基因，并小翻译成蛋白质，而是在体内代谢过程中起到多种调控作用。,Dicer与miRNA,miRNADicer与miRNA,28,哺乳动物中miRNA的成熟需要经历,四,个过程,。,首先,从最原始的编码miRNA的基因组DNA转录形成miRNA的原始转录物(primary transcript,pri-miRNA),此过程需要RNA多聚酶II的参与，发生在细胞核中，,接下,来,需要在Drosha的作用下生成pre-miRNA;,然后,，生成的pre-miRNA在输出蛋白5(exportin-5,Exp-5)的协助下从细胞核中转运到细胞质中;,最后,，细胞质中的pre-miRNA在DCR的作用,下,剪切成2125 nt的双链成熟的mi RN。,随后，成熟的miRNA将被组装进入RISC中形成非对称RISC复合体。该复合体会结合到目标靶mRNA上，在大多数情况卜，该复合体中的单链miRNA与靶mRNA的3 UTR小完全互补配对，从而阻断该基因的翻译过程,。,哺乳动物中miRNA的成熟需要经历四个过程。首先从最原始的编,29,RNA干扰与应用精讲课件,30,核糖核酸酶III超家族,RNA干扰(RNAi)作为真核细胞转录后调节机制出现后，随着研究的进一步深入人们研究的焦点逐渐集中在核酸酶对双链RNA(dsRNA)的识别及降解方面。RNAi具有多种功能，它的功能均与酶的活性有关。研究人员对,RN,Ai的研究是希望能在生铡术和生物医学中得以应用。回顾早期的研究，这些研究发现了典型的d,s,RNA特异性酌即核糖核酸酶,III,。,RNase III,曾一度被认为是一种独特的细菌,酶,。尽管已经在许多的真核细胞中发现了ds,RNA,分解的作用，但是它与细菌,RNase III,之间的关系还不清楚,。在对酶母RNA加工反应以及基因组,测序工程的生化遗传等研究中,。,人们发现真菌、植物以及动物体内的,RNase III,是同源物,。,在此基础上最终形成了,RNase III,超家族概念。,核糖核酸酶III超家族 RNA干扰(RNAi)作为真核细胞转,31,RNA干扰与应用精讲课件,32,基因沉默中依赖于RNA的RNA聚合酶,在早期的分子生物学中，细胞中遗传信息的流程图被定义为“中心法则：即从DNA到,RN,A的复制，从DNA到,RNA,的转录及从RNA到蛋白质的翻译。该框架图之外越来越吸引,人,们,注意,的一个途径是出依赖,R,NA的,RN,A聚合酶(,RdRP,)介导的从,RN,A到RNA的复制过程。当RNA为基本的遗传物质时，,Rd,RP在其进化过程中一定发挥着重要的作用,。,这些酶在当代的生物学中同样右着关键的作用。,Rd,RP出不同种,RNA,病毒进行编码，进行基因组的复制、m,RN,A的合成、,R,NA的重组和其他的一些功能,。,基因沉默中依赖于RNA的RNA聚合酶 在早期的分子生物学中，,33,番茄RdRP是从健康的番茄叶及类病毒感染的叶子中分离出来的。为研究RdRP的生化性质，对纯化的蛋白质进行了分析。,RdRP的引物要求的实验分析证明在有或无引物存在的情况下，该酶均可以催化转录的进行。在与模板的3端互补的RNA或DNA的2个或3,个核苷酸,存在的情况下，均可以观察到引物的延伸。在缺乏引物时，,RdRP,在单链模板的3,端,核苷酸,或其附近,启,动转录。,尽管体外分析证明细胞内RdRP有催化活性，但应当清楚，纯化出来的蛋白质可能仅是较大的体内RdRP复合体的核心部分，其他蛋白质的存在可能会改变该酶的特异性及活性。,番茄RdRP是从健康的番茄叶及类病毒感染的叶子中分离出来的。,34,RNA干扰可以由病毒的dsRNA、自身互补的转录本或者有义的转基因等激发。在植物中这种现象叫做共抑制。通过可以产生反义的或自身互补的转录本的复杂的转基因插入子，或者通过具有高表达水平的单链的转基因均可以激发共抑制。对于单链的有义的转基因，早熟的转录终端所引起的异常的转录本可以在RdRP作用下，变为双链的RNA。RdRP为真菌、植物以及线虫中RNAi所必需，通过以siRNA为引物合成新的dsRNA。,RdRP和,RN,A沉默,RdRP和RNA沉默,35,RdRP的转基因沉默是由XRN4突变所引起的。XRN4是一种核酸酶通过去帽和53外切核酸酶的作用在mRNA的代谢中起作用。当XRN4和RdRP均发生突变时，去帽的转基因m,RN,A在植物中堆积。而这些缺乏帽子结构的,mRNA,则易于在R,dRP,作用下，启动并维持,RN,A,i,。不同的种系的证据表明RNA沉默的一些方面可能有细胞内R,dRP,的参与。在与有义转基因有关的肌沉默的早期实验中，用细胞内的将R,dRP,靶m,RN,A复制生成互补的,RN,A来解释沉默的序列特异性。此外，也可通过向细胞中注入一些ds,RNA,的分子而在动物或植物体内诱导全身、并传递给子代的,RNA,沉默现,像。,RdRP的转基因沉默是由XRN4突变所引起的。XRN4是一种,36,RNAi是一种高度特异的过程，其发生过程主要分为,3,个阶段:,首先，dsRNA在细胞内在DCR的作用下被切割成小的干扰性RNA，即siRNA。,第二步为沉默复合体的形成。,第三步为沉默复合体被激活,。,RNAi,作用机制,RNAi是一种高度特异的过程，其发生过程主要分为3个阶段:R,37,RNA干扰与应用精讲课件,38,RNAi技术的特点,RNAi技术具有一些重要特点,：,高度特异性。,放大性,。,高效性。,遗传性。,不对称性。,扩散性,RNAi技术的特点RNAi技术具有一些重要特点：,39,RNAi操作的基本程序,以植物细胞工程中应用的RNAi技术为例，过程可以分成以下几个环节：,确定目的基因；,设计RNAi序列；,获得RNAi产物；,RNAi转染；,检测RNAi的作用效果,RNAi操作的基本程序 以植物细胞工程中应用的RNAi技术为,40,RNA干扰与应用精讲课件,41,RNA干扰技术,核心技术：,siRNA（ Small interfering RNA）的设计与合成,siRNA的标记,siRNA的转染,RNAi的检测（核酸及蛋白水平）,RNA干扰技术核心技术：,42,siRNA的设计,1.siRNA的一般结构：,哺乳动物：21-23bp dsRNA,其它生物：更长的片段,dTdT（UU）,（UU）dTdT,siRNA的设计1.siRNA的一般结构：dTdT（UU）（,43,siRNA的设计,设计流程（选择siRNA靶位点）,从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA 3端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点；根据5和3非翻译区（UTR)及靠近起始密码子（75个碱基之内）等富含调节蛋白结合位点区域来设计siRNA。,将候选靶位点与相应的基因组数据库比较，去掉哪些与其它编码序列同源的靶序列。,设计阴性对照：阴性对照siRNA应与siRNA的核苷酸组成相同但没有与基因组明显同源的序列。一般通过改变siRNA核苷酸顺序并经同源序列比较确证而得。,siRNA的设计设计流程（选择siRNA靶位点）,44,序列同源性分析：,将,siRNA,序列和相应的基因组数据库（人，或者小 鼠，大鼠等等）进行比较，,排除那些和其他编码序列 /,EST,同源的序列,。例如进行,BLAST,搜索分析（,www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/,）,选出合适的目标序列进行合成,并非所有符合条件的,siRNA,都一样有效，其原因还不清楚，可能是位置效应的结果，因此对于一个目的基因，一般要选择,3-5个靶位点来设计,siRNA,设计阴性对照,通常的做法是将选中的,siRNA,序列打乱，同样要检查 结果以保证它和其他基因没有同源性。或者用,housekeeping genes,作对照,.,序列同源性分析：,45,补充：,Whitehead,研究所已研发了,siRNA,的自动选择方法，并于网站：,http:/jura.wi.mit.edu/bioc/siRNA/home.ph,p,上向公众开放这个软件允许使用者定义序列基序和,G/C,含量，并自动在人和鼠的基因组数据库中搜索,siRNA,序列，以防错配。,疑难解答：,假如,siRNA,不起作用，应首先确定所使用的靶序列和细胞是否来源于相同的组织。是否使用了错误的细胞系。,应确定用于进行,RNAi,的,siRNA,双链对选择的,mRNA,序列是否可靠的，因后者可能包含序列上的错误、突变（如在癌细胞中）或存在多态性。,补充：Whitehead 研究所已研发了siRNA的自动选择,46,siRNA,的合成,体外转录法合成,siRNA,双链,RNA,合成,非特异,siRNA,合成,体内转录合成,siRNA,siRNA,表达载体在细胞中表达,siRNAs,以,PCR,制备,siRNA,表达框进行体内转录,利用病毒系统实现体内表达,siRNA,优点：不需要直接操作,RNA,siRNA的合成体外转录法合成 siRNA 双链 RNA合,47,siRNA,表达载体,BD Knockout RNAi vectors,siRNA表达载体BD Knockout RNAi vect,48,pSIREN,载体分为两种：,pSIREN-Shuttle,和,pSIREN-RetroQ。pSIREN,载体带有,U6,启动子，均为线性载体，,pSIREN-RetroQ,载体带有真核筛选标记-嘌呤霉素抗性基因,pSIREN-Shuttle,可以进一步应用于构建腺病毒载体；,pSIREN-RetroQ,可以进一步应用于构建逆转录病毒载体，应用于感染难以转染的细胞。,pSIREN 载体分为两种：pSIREN-Shuttle和p,49,siRNA,表达框进行体内转录,siRNA,表达框架,(siRNA expresion casetes,，,SECs),是一种由,PCR,得到的,siRNA,表达模板，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。,siRNA表达框进行体内转录siRNA表达框架(siRNA,50,谢谢,观赏,WPS,Office,Make Presentation much more 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