,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,空肠弯曲菌检测,空肠弯曲菌检测,一、空肠弯曲菌的分类和特性,：,属于弯曲菌属。,主要包括空肠弯曲菌（,Campylobacter jejuni,）、结肠,(,或大肠）弯曲菌（,Campylobacter coli,）、海鸥弯曲菌（,Campylobacter lari,）、乌普色拉弯曲菌（,Campylobacter upsalensis,）、胎儿弯曲菌（,Campylobacter fetus,）等,11,种。,其中空肠弯曲菌（,C.jejuni,）对食品安全的威胁最为严重。,一、空肠弯曲菌的分类和特性：属于弯曲菌属。,空肠弯曲菌（,Campylobacter jejuni,）是从,20,世纪,80,年代起受到国内外广泛重视的人畜共患病菌。,致病性：,人类：急性细菌性肠炎、格林,-,巴利综合征,（,GBS,）、食物中毒。,动物：雏鸡腹泻与肝炎；火鸡的肝炎与蓝冠病。犊牛的腹泻；绵羊的腹泻或流产。,空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是从2,空肠弯曲菌的生物学特性,革兰氏,染色,阴性。,呈弧形，,S,形或螺旋形；,菌体两端尖，有极鞭毛，能做,快速直线或螺旋体状运动；,1.5,5m0.2,0.5m,，,无荚膜。,微需氧环境：,5%O,2,、,10%CO,2,和,85%N,2,。,最适生长温度：,42-43,，,37,可生长，,30,以下不生长。,空肠弯曲菌的生物学特性 革兰氏染色阴性。呈弧形，S形或螺旋形,空肠弯曲杆菌的流行病学和临床表现,宿主：,家禽、野生鸟类为最主要的传染源。,(Rosef,等在,1981,年调查了,129,个野生鸟类，结果 表明,24.8%,携带空肠弯曲菌,),鸟类迁移会造成病原菌对湖水与河水的污染,。,空肠弯曲杆菌的流行病学和临床表现 宿主：,细菌分布范围,*该菌分布广泛，已从多种动物中分离出；也发现于食物与饮水中，尤其是畜禽肉及脏器与鲜奶。,*食用动物中,鸡的带菌率为首位,，其次为猪。主要分布在活鸡的消化系统中如腺胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、泄殖腔等。,*该菌在人或动物的粪便中存活约,4,周；在被污染的水源中可存活约,5,周。,细菌分布范围,感染途径：,*,传播途径主要是由于摄取了该菌污染的食物与,饮水后，细菌在人肠道内大量生长繁 殖，引起,急性肠炎。,*,被污染的禽肉与未经过巴氏消毒的牛奶是导致,发病的主要原因,.,感染途径：,患者临床表现：,患者表现为发热、腹泻、呕吐或肌肉痛。潜伏期平均,3-5,天，病程约,7-10,天，粪便的特征是有时带血，镜检中有多形核白血球，重症病例也有痢疾样血、粘液粪便。,患者临床表现：,根据美国疾病控制与预防中心（,USA-CDC,）多年的美国食源性病原微生物引起发病人数的统计资料，空肠弯曲菌导致的病例数,排名第二,。,禽肉、生牛奶,中的空肠弯曲菌被美国列为重点监测食源性致病菌之一。,32,nd,CCFH,（,1999,年）提出,5,组优先评估的,“,病原,-,食品,”,组合,其中包括,“禽肉,-,空肠弯曲菌”,。,空肠弯曲菌在许多发达国家也是被报告最普遍的胃肠炎致病菌之一，如：美国、英国、丹麦、芬兰、爱尔兰、荷兰、挪威、瑞典、瑞士等。,根据美国疾病控制与预防中心（USA-CDC）多年的美国食源,二、空肠弯曲菌的检验技术,二、空肠弯曲菌的检验技术,空肠弯曲菌,空肠弯曲菌：,在微需氧条件下,42,生长而,25,不能生长，在选择性固体培养基上形成特征性菌落，按照本标准检验时具有相符合的运动特性、生长特性与生化特性的革兰氏阴性菌。,空肠弯曲菌空肠弯曲菌：,设备和材料,微需氧培养装置,:,能够提供微需氧条件（,5%O2,、,10%CO2,和,85%N2),如使用产气剂的,厌氧罐,/,袋或其它,可代用的装置等。,设备和材料微需氧培养装置:能够提供微需氧条件（5%O2、,三气培养箱（如,Binder,等,),三气培养箱（如Binder等),弯曲菌检验程序,弯曲菌检验程序,增菌液接种,方法一：稀释处理 将,24 h,和,48h,的增菌液原液分别划线接种,mCCDA,平板,.,（备注：也可选用,CFA,显色平板或,SimPlate,分离鉴定及定量培养基）,优点：经济、方便,缺点：可能会有杂菌干扰,增菌液接种 方法一：稀释处理 将24 h和48h的增菌液原,mCCDA,平板上所挑取的可疑菌落通常带有金属光泽、扁平、湿润、沿划线生长。,mCCDA平板上所挑取的可疑菌落通常带有金属光泽、扁平、湿,CFA,显色平板上所挑取的可疑菌落为红色、突起、湿润，菌落较小直径约,2,3mm,，边缘有一圈红色的透明环，中间有一个圆形的不透明、颜色较深的红色小点的菌落。,食品中空肠弯曲菌检测-江苏出入境课件,将所挑取的,3,5,个可疑菌接种到不含抗生素的,哥伦比亚血琼脂平板，微需氧条件下,420.5,培养,24 h-48h,后，进行后续的空肠弯曲菌鉴定。,食品中空肠弯曲菌检测-江苏出入境课件,空肠弯曲菌的鉴定,快速鉴定,1.,形态与动力性检测,*对挑取菌落进行革兰氏染色镜检，空肠弯曲菌为革兰氏阴性，弯曲如小逗点状，两菌体的末端相接时，呈,S,形、海鸥展翅状或螺旋状。,*对挑取可疑菌落制作湿片，镜检可见本菌呈螺旋样运动。,空肠弯曲菌的鉴定快速鉴定,快速鉴定,2.,氧化酶试验,使用铂,/,铱接种环或玻璃棒，挑取单个菌落的一部分，然后接种到用氧化酶试剂润湿的滤纸上，如果在,10,秒内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性，弯曲菌则为阳性。,快速鉴定 2.氧化酶试验,快速鉴定,3.,过氧化氢酶检测,挑取一环菌落培养物，加到在干净显微镜玻片上的一滴,3,过氧化氢溶液中，如果在,30,秒内出现气泡则判定结果为阳性。,快速鉴定3.过氧化氢酶检测,快速鉴定,4.,马尿酸盐水解试验,挑取欲检测的菌落培养物，加到盛有,0.4mL 1,的马尿酸钠的试管中制成菌悬液，注意不要带入培养基琼脂。混合均匀后在,37,水浴中温育,2 h,或,36,培养箱中温育,4 h,。轻轻地在马尿酸盐溶液的顶部加入,0.2mL,茚三酮溶液，不要振荡，在,37,水浴或,36,培养箱中温育,10 min,后判读结果。若出现黑紫色则为阳性；若出现淡紫色或没有颜色变化则为阴性。,快速鉴定4.马尿酸盐水解试验,快速鉴定,5,.,吲哚乙酸脂水解试验,挑取欲检测的菌落培养物，加到羟基吲哚醋酸盐纸片上面，再滴加一滴灭菌蒸馏水。如果吲哚乙酸脂水解，则在,5,10min,内出现深蓝色；若没有颜色变化则表示水解反应没有发生。,快速鉴定5.吲哚乙酸脂水解试验,后续鉴定,1.,微需氧条件下,25,生长试验,2.,有氧条件下,420.5,生长试验,3.,先锋霉素（头孢霉素）的敏感性检测,（可选）,ISO,：奈啶酮酸的敏感性检测,（越来越多的,C.jejuni,与,C.coli,的非特异,性菌株出现）,后续鉴定,后续鉴定,微需氧条件下,25,生长试验,挑取欲检测的菌落培养物，接种到哥伦比亚血琼脂平板上，,25,微需氧条件下培养,484h,，若为空肠弯曲菌则不出现生长,。,后续鉴定微需氧条件下25生长试验,后续鉴定,有氧条件下,420.5,生长试验,挑取欲检测的菌落培养物，接种到哥伦比亚血琼脂平板上，,420.5,有氧条件下培养,484 h,，若为空肠弯曲菌则不出现生长。,后续鉴定有氧条件下420.5生长试验,后续鉴定,先锋霉素（头孢霉素）的敏感性检测（可选）,挑取菌落培养物，在布氏肉汤中制备成浓度为,0.5 McFarland,的菌悬液，再用布氏肉汤制备,1,：,10,的稀释液，在,5,Mueller Hinton,血琼脂平板上进行涂布，静置,5min,后去除多余液体，将平板在,36,培养箱中放置,10 min,。将先锋霉素（头孢霉素）药敏纸片放在琼脂表面。培养皿盖子在上面，,36,微需氧条件下将平板培养,222h,。如果细菌紧贴着纸片生长则为有抗性；如果纸片周围出现不同程度的细菌抑制生长则为敏感,后续鉴定先锋霉素（头孢霉素）的敏感性检测（可选）,主要弯曲菌的生化特性与鉴定表：,空肠弯曲菌 结肠弯曲菌 海鸥弯曲菌 乌普萨拉弯曲菌,.,形态、动力性：革兰氏阴性，弯曲如小逗点状，两菌体的末端相接时呈,S,形或,螺 旋状或海鸥展翅状，并呈现螺旋样运动,氧化酶试验：阳 性,过氧化氢酶试验：,或微弱,马尿酸盐水解试验：,吲哚乙酸脂水解试验：,先锋霉素敏感性：,R R R S,微需氧条件,25,生长试验：不生长,有氧条件,42,生长试验：不生长,（注：阳性；,阴性；,S,敏感；,R,有抗性）,主要弯曲菌的生化特性与鉴定表：,已试用过的弯曲菌生化鉴定与筛选检测的商品化试剂,C.1,弯曲菌的生化鉴定系统,C.1.1 API,为手工生化鉴定系统，用于弯曲菌的菌种鉴定，鉴定结果准确，所需时间,1,天。（,需要一定的技术与经验积累,）,C.1.2 VITEK 2,为自动生化鉴定系统，可以鉴定出空肠弯曲菌空肠亚种、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌胎儿亚种，且结果准确，操作简便，所需时间,6,小时左右。,已试用过的弯曲菌生化鉴定与筛选检测的商品化试剂 C.1,微生物,API,鉴定系统,微生物API鉴定系统,C.2,弯曲菌的筛选检测方法,C.2.1,miniVidas,用于弯曲菌的初筛，原理为酶联荧光免疫分析,(ELFA),方法。对于结果阴性的可以直接判定为阴性，对于结果阳性的需进一步确认，可比传统方法快,2,天。（具体参照厂家说明）,C.2.2 BAX,系统原理为利用,PCR,进行基因检测，用于空肠弯曲菌和大肠弯曲菌的筛选，阳性结果仍需确认。,食品中空肠弯曲菌检测-江苏出入境课件,空肠弯曲菌检测流程,样本制备,增菌,检测,样本,+,选择性增菌 肉汤,微需氧培养,阴性结果,无空肠弯曲菌,初筛方法检测,选择性平板进行分纯培养,阳性结果,经典培养鉴定方法,微生物手工,/,自动,生化鉴定系统,基因鉴定方法,空肠弯曲菌检测流程样本制备增菌检测样本+选择性增菌 肉汤,谢谢大家！,谢谢大家！,