,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,细胞培养,1,细胞培养1,一 原代培养（略）,2,一 原代培养（略）2,二,.,传 代 培 养,准备及注意事项,换 液,传 代,冻 存,复 苏,MTT,3,二. 传 代 培 养 准备及注意事项3,准备事项,紫外灯照射细胞室,30,分钟,风机运行,10,分钟后方可进入实验室,.,穿专用的口罩,帽子,拖鞋,工作衣等,.,带手套,并用酒精擦拭之,.,准备好实验必需用品,.,超净工作台内操作前用酒精棉球擦拭台面,.,超净工作台内操作完成后，,要用酒精棉球擦拭台面,除了酒精灯,镊子,试管架等物品外,其他都要拿出工作台外,.,紫外灯照射,30,分钟,.,4,准备事项紫外灯照射细胞室30分钟,风机运行10分钟后方可进,换液,把细胞培养瓶从培养箱中拿出,拧紧盖子,;,观察瓶内培养基的颜色,是否浑浊等,;,放在倒置显微镜下观察细胞生长状况。,放入超净工作台内,点燃酒精灯,拿培养瓶口在酒精灯火焰上转两圈以上,至少三秒,.,取下盖子,烧瓶口,;,倒掉培养基,烧瓶口,;,拿出,PBS,液瓶子,烧瓶口和镊子,;,用镊子将塞子取出,烧瓶口（至少,10,圈）。,5,换液把细胞培养瓶从培养箱中拿出, 拧紧盖子;5,6.,用吸管吸取,3ml,的,PBS,，打入培养瓶内。烧培养瓶口，,来回晃动,PBS100,次后到掉,PBS,。重复此操作一次。,7.,拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，,烧瓶口（至少,10,圈）。,8.,用吸管吸取,5ml-8ml,的培养基打入培养瓶内，烧瓶口，,镊子和盖子；,9.,盖上盖子，倒置显微镜下观察，之后标明名称和日期，,酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培养箱内即可。,注意：,1.,打开培养箱时尽量不要说话；,2.,步骤,9,中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。,6,6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养瓶口，6,传代,1.,把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子；,2.,观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在,倒置显微镜下观察细胞生长状况。,3.,放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶,口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。,4.,取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口；,5.,拿出,PBS,瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞,子取出，烧瓶口（至少,10,圈）。,7,传代1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子；7,6.,用吸管吸取,3ml,的,PBS,，打入培养瓶内。烧培养,瓶口，来回晃动,PBS100,次后到掉,PBS,。重复此,操作一次。,7.,拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取,出，烧瓶口（至少,10,圈）。,8.,用吸管吸取,1ml,的胰酶，打入培养瓶内，烧培养,瓶口和盖子，盖上盖子；,9.,拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后,用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；,5,分钟,后取出；,8,6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养8,10.,在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若,细胞变成单个圆形，则可进行传代。,11.,拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶,口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。,12.,拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子,将塞子取出，烧瓶口（至少,10,圈）。,13.,用吸管吸取,5ml,的培养基打入培养瓶内，,用吸管吹打成单个细胞悬液。计数，分装,即可。,9,10.在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若9,冻存,1.,把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子；,2.,观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在倒置显微镜下观察细胞生长状况。,3.,放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。,4.,取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口；,5.,拿出,PBS,瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，烧瓶口（至少,10,圈）。,10,冻存1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子；10,6.,用吸管吸取,3ml,的,PBS,，打入培养瓶内。烧培养瓶口，来回晃动,PBS100,次后到掉,PBS,。重复此操作一次。,7.,拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，烧瓶口（至少,10,圈）。,8.,用吸管吸取,1ml,的胰酶，打入培养瓶内，烧培养瓶口和盖子，盖上盖子；,9.,拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；,5,分钟后取出；,10.,在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞变成单个圆形，则可进行传代。,11,6. 用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养瓶口,11.,拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶,口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。,12.,拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子,将塞子取出，烧瓶口（至少,10,圈）。,13.,用吸管吸取,5ml,的培养基打入培养瓶内，用吸管,吹打成单个细胞悬液。,14.,用吸管将细胞悬液移至,5ml,离心管中，盖上盖,子，在离心机内离心，,1500,转,/,分钟，时间为,15,分钟。,15.,离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉,塞子，烧管口。,12,11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶12,16.,弃上清液，加冻存液,2ml,吹打，使细胞均匀混在冻存液中，再加,3ml,冻存液，用吸管吸出打入多个冻存管中，每管,1.5ml,。,17.,盖上盖子，用封口膜封好,标上细胞名称和日期,.,18.,冻存方式：,430,分钟，,-2015,分钟，,-8060,分钟，最后转移到液氮罐内。,注意：,冻存管移动时要夹在冰块中间。,13,16.弃上清液，加冻存液2ml 吹打，使细胞均匀混在冻存液中,复苏,1.,取一敞口瓶，内装蒸馏水，放入电热恒温水槽中，温度设置为,39.0,。,2.,等达到,39.030,分钟后，用镊子将欲复苏的细胞从液氮管中取出，快速放入敞口瓶内，晃动，使冻存管内完全液化。,3.,用酒精擦拭冻存管，放入工作台内。,4.,用镊子将封口膜夹掉，轻烧管口；,5.,用吸管吸出冻存管内的细胞悬液，打入已装有,5ml,新鲜培养基的培养瓶内。,14,复苏1. 取一敞口瓶，内装蒸馏水，放入电热恒温水槽中，温度,6.,烧瓶口，镊子和盖子；盖上盖子，,在倒置显微镜下观察。,7.,用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内,.,注意：,步骤,2,中，蒸馏水不要没过冻存管口,所有步骤结束过,24,小时后一定要换液；,15,6. 烧瓶口，镊子和盖子；盖上盖子，15,MTT,法,1.,实验开始前，,96,孔板应在超净台紫外灯下照射,2,个小时以上。,2.,从培养箱中拿出培养瓶，观察，加,PBS,，加胰酶消化，加培养基，计数。,（方法及步骤同传代,1-13,步。）,3.,加培养基，调整细胞浓度为,10000,个,/200l.,4.,加到,96,孔板内,每板,6,行,8,列共,48,孔,每孔,200l.,5.,盖上,96,孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下观察，标明名称，序号和日期。,16,MTT法1.实验开始前，96孔板应在超净台紫外灯下照射2个小,6.,用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养,24,小时。,7.,从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内，,用,200l,的枪将孔内的培养基吸出；,8.,加入不同浓度的药物的无血清培养基,每孔,200l,。,9.,盖上,96,孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下,观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养,24,小时。,10.,从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内，,每孔加,MTT,液,20l,。,17,6. 用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24小时。17,11.,盖上,96,孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下,观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养,4,小时。,12.,取出,96,孔板，倒掉孔内的液体，每孔加,DMSO150l,，放入酶标仪内，振荡,600,秒，,读数即可。,注意：,本实验以,CHL,细胞为例,.,加,DMSO,时，带口罩和手套。,放入酶标仪内时，,96,孔板勿盖盖子。,多重复几次。,18,11.盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下18,溶液的配制,PBS,RPMI1640,培养基,消化液,冻存液,清洁液,MTT,其它溶液,19,溶液的配制PBS19,PBS,配制,之后，加,1000ml,三蒸水,调节,PH,值在,7.2-7.4,之间,高压,121,30,分钟,4,备用。,名称,质量,(,单位,:,克,),NaCl,KCl,Na,2,HPO,4,.12H,2,O,KH,2,PO,4,8.00,0.20,3.49,0.20,20,PBS配制之后，加1000ml三蒸水,调节PH值在,RPMI1640,培养基的配制：,取一小袋,1640,培养粉，加高压过的三蒸水,800ml,，在,1000ml,的烧杯中用玻璃棒搅拌溶解；,加碳酸氢钠,2.0g,，再加三蒸水定容至,1000ml,；,加青霉素,(100U/ml),，链霉素,（,100,g/ml,）；,在超净工作台内过滤除菌，分装成,180ml,，,-20,备用。,注意,烧杯要泡过酸，并在紫外线下照射至少,30,分钟。,21,RPMI1640培养基的配制：21,消化液的配制,称取胰蛋白酶粉,0.5,克，溶入,PBS,缓冲液,200ml,，,混匀，调整,PH,值到,7.2,，,过滤除菌，用,1.5ml,的,EP,管分装，,-20,冻存。,取少许放入已培养的无污染的培养基中,培养。,22,消化液的配制22,冻存液的配制,高压过的二甲基亚砜,DMSO,，胎牛血清和无血清培养基按,1:3:6,的比例配制。,例如配制,10ml,的冻存液：,高压的小瓶中加,3ml,过滤的胎牛血清，,再加,6ml,培养基，最后加,1ml,的,DMSO,混匀即可。,23,冻存液的配制高压过的二甲基亚砜DMSO，胎牛血清和无血清培,清洁液的配制,重铬酸钾,(,单位,:,克,),浓硫酸,(,单位,:ml),蒸馏水,(,单位,:ml),弱液,100,100,1000,次强液,120,200,1000,强液,63,1000,200,24,清洁液的配制重铬酸钾浓硫酸蒸馏水弱液100 1001000,一般常用次强液。新配制的清洁液为棕红色，,多次使用后，成绿色时就不能再用,需重新配制。,注意：,保护自己；,先将重铬酸钾完全溶解于水中（必要时可加热帮助溶解），然后缓慢加入浓硫酸，以免产生热量太多，使容器破裂。,25,一般常用次强液。新配制的清洁液为棕红色，25,噻唑蓝,MTT,液配制,方法,称取,25mgMTT,加入,5ml PBS,液,混匀,即成,5mg/ml,的,MTT,液；,用,0.22m,的微孔滤器除菌,避光, 4,保存一周内使用,.,原理,活细胞的线粒体的乳酸脱氢酶可使,MTT,（黄绿色）分解，产生兰紫色结晶状甲赞颗粒，积淤细胞内和细胞周围；其量与细胞数成正比，也与细胞活力成正比。,注意,MTT,法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数,.,26,噻唑蓝MTT液配制方法26,其它溶液的配制,95%,到,75%,的酒精的配制比例为,4:1,，,例如,配制,100ml75%,的酒精,80ml 95%,酒精加,20ml,三蒸水即可。,36%-38%,的浓,HCL,到,5%,的稀,HCL,的配制比例为,3:17,，,例如,配制,1000ml,的,5%,的稀盐酸,150ml,的浓,HCL,加,850ml,的蒸馏水即可。,27,其它溶液的配制95%到75%的酒精的配制比例为4:1，27,细胞计数,方法,吸出细胞悬液少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。,静置三分钟,镜下观察，计数板四大格细胞总数。公式为：细胞数,/ml=,四大格细胞总数,/4 10,4,个,注意,镜下见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算,;,若细胞团数量占,10%,以上，重新制备细胞悬液。,计数时，计左侧和上方的压线细胞，右侧和下方的压线细胞不应该计在本方格之内。,28,细胞计数方法28,血清灭活,把血清置于,56,的水浴锅里待完全溶解后开始计时，,30,分钟后分装成,20ml,的小瓶，放,-20,备用。,29,血清灭活把血清置于56的水浴锅里待完全溶解后开始计时，3,实验用品的洗涤,橡胶，塑料用品,玻璃器皿,30,实验用品的洗涤橡胶，塑料用品30,橡胶，塑料用品,用自来水冲洗后放入专用烧杯内,加入蒸馏水，使之淹没物品稍许，放在电炉上加热；,等水开时开始记时，三十分钟后取下，倒掉烧杯内的水，自来水冲洗,3,遍，蒸馏水冲洗,2,遍，放烤箱下层中烘干；,烘干后浸泡在盐酸中，至少,30,分钟；,将盐酸倒掉，用自来水冲洗十遍，蒸馏水冲洗三遍，放入烤箱上层烘干,烘干后放入饭盒内高压，之后放烤箱上层再次烘干即可使用,31,橡胶，塑料用品用自来水冲洗后放入专用烧杯内,加入蒸馏水，使,玻璃器皿,用自来水冲洗三遍，用蒸馏水洗三遍，放入烤箱下层烘干，,放入清洗缸即酸缸内，让整个器皿没入清洗液中,时间为过夜或者至少,8,个小时以上,.,取出器皿，用自来水冲洗十遍，再用蒸馏水冲洗三遍后，放入烤箱上层烘干 。,取出器皿，高压后，放烤箱上层，再次烘干即可使用。,32,玻璃器皿用自来水冲洗三遍，用蒸馏水洗三遍，放入烤箱下层烘干，,