单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子克隆工具酶,限制和修饰,(restriction and modifying ),周口师范学院生命科学系,进行基因工程操作，首先要获得需要重组和能够重组的,DNA,片段。,（如何获得？）,用相应的酶进行切割，就可以获得含有完整基因片段、复制起始位点、转录启动子或转录区等具有特定功能的,DNA,片段。,那么，如何将需要的,DNA,片段切割和连接呢？,1,限制酶的发现,20,世纪,30,年代初发现噬菌体在不同菌株之间的限制现象与不受限制现象，,60,年代提出对上述现象解释的假设,:,内切酶能识别并切断外源,DNA,的某些位点使其失活而限制外来噬菌体的繁殖，属,限制酶类,。,E.coli,菌株,噬菌体感染率,（,K,）,（,B,）,（,C,）,K,1,10,-4,10,-4,B,10,-4,1,10,-4,C,1,1,1,噬菌体不同感染株对,E.coli,不同菌株的感染率,说明：,K,菌株和,B,菌株中有一种限制系统，可以排除外来的,DNA,。,C,菌株不能限制来自,K,菌株和,B,菌株的,DNA,。,这种限制作用就是限制酶降解外源,DNA,，维护宿主遗传稳定的保护机制。,限制酶的功能：,降解外源,DNA,，从而阻止其复制和整合到宿主细胞中。,修饰酶的功能：,对自身某个碱基进行甲基化，从而保护自身的,DNA,不被降解。,核酸酶：,通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶。,核酸内切酶：,从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂成小片断。,核酸外切酶：,从核酸分子的末端开始逐个地切割降解核苷酸。,限制性核酸内切酶,(restriction,endonuclease,）：,一类能够识别双链,DNA,分子中的某种特定核苷酸序列，并切割,DNA,双链结构的内切核酸酶。,2,限制酶的分类,:,根据其识别和切割序列的特性，催化条件及修饰活性等，一般将限制酶分为,、,、,三类。,广义指上述三个系统中的限制酶；,狭义指,II,型限制酶。,1968,年，从,E,Coli K,株发现限制,酶能降解非同源,DNA,，,但切口少，,不 能产生专一性切口,，归类为,I,类限制酶,。,1970,年，从流感噬血杆菌中分离到一种限制酶，对,DNA,的 切割有一定的切口，,要求特异的识别序列,，很快被用于,DNA,结构与功 能研宄，是,II,类限制酶,特性,I,型酶,II,型酶,III,型酶,限制和修饰,双功能酶,内切酶与甲基化酶分离,双能酶,识别位点,非对称序列,回文对称结构,非对称序列,切割位点,在距识别位点至,1000bp,处随机切割,识别位点上,距识别位点,24,26,bp,处,序列特异性切割,否,是,是,分子克隆中应用,无,广泛,很少,3,限制酶的,命名原则,第一个字母,，,大写,，来源宿主属名的第一个字母；,第二、三个字母,，,小写,，取自种名的头,2,个字母；,第四个字母,，,大写,，取自它来源菌株系；最后用罗马数字大写，代表同一菌株中不同限制酶的编号。,前,3,个字母斜体,例：,E.coR,I,E,为大肠杆菌的属名,(,escherichia,),的第一个字母,co.,种名,(coli),的头两个字母,R,表示所用大肠杆菌的菌株,I,表示该细菌中分离出来的这一类酶的编号,E,Coli,Rye l3,株分离到,Eco,RI,Eco,RII,，,Eco,RV,4,限制酶识别序列,限制酶在,dsDNA,上能够识别的特殊核苷酸序列。,E.,co,R,I,GAATTC,Hin,d,III,AAGCTT,Sau,3A,GATC,Dra,II,PuGGNCCPy,Pu,代表,A,或,G,Py,代表,T,或,C,N,代表任意碱基,偶数,核苷酸组成的识别序列，以中线为轴，两侧核苷酸互补对称。,E.,co,R,I,GAATTC,CTTAAG,奇数,核苷酸组成的识别序列，以,N,N,为轴，两侧核苷酸互补对称。,GT,N,AC,CA,N,TG,根据识别序列的规律性，找可能的识别序列。,偶数序列，先找,GC,、,CG,、,AT,、,TA,，然后找其两侧的核苷酸。,N,GC,N N,AT,N,N,CG,N N,TA,N,奇数序列，先找,GNC,、,CNG,、,ANT,、,TNA,，然后找其两侧的核苷酸。,N,GNC,N N,ANT,N,N,CNG,N N,TNA,N,N,代表任意碱基。,一般说，在同一个,DNA,分子中，识别序列短的出现的概率大，反之概率小。,原则上有,n,个碱基的识别序列的出现概率是,1/4,n,。,如,Sau,3A,识别序列,GATC,，间隔,256(4,4,),个核苷酸就有一次机会出现这个识别序列。,E.,co,R,I,GAATTC,？,在一个环状,DNA,分子上，若某种限制酶有,n,个识别序列，经完全酶切后产生,n,个,DNA,片段。,在一个线性,DNA,分子上，若某种限制酶有,n,个识别序列，经完全酶切后产生,n+1,个,DNA,片段。,富,AT,的识别序列在富,AT,的,DNA,分子中出现的概率高，在富,GC,的,DNA,分子中出现的概率低。,富,GC,的识别序列？,出现概率低的限制性核酸内切酶称稀切酶,(rare cutting enzymes),。,有的限制酶可识别两种以上的核苷酸序列。,例：,Acc,I GT,AT,AC,GT,CG,AC,Dde,I CT,A,AG,CT,T,AG,CT,G,AG,CT,C,AG,5,限制酶产生的末端,切割位点,：,DNA,在限制酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置。,一般用,“,/,”,或,“,”,表示。,具体位置：,在识别序列内部或两侧,。,例：,G GATCC AT CGAT,GATC CATC,黏性末端,(sticky end),：,DNA,分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构，它们能通过互补碱基间的配对而重新连接起来。,5,端黏性末端,3,端黏性末端,平末端,(blunt end):,若限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的片段末端为平末端。,核苷酸,奇数,的识别序列被相应的限制酶切割后，产生的末端都是黏性末端。,核苷酸,偶数,的识别序列被相应的限制酶切割后，产生的末端是,？,？,限制酶 识别序列 产 物,Alu,I,5-AG,CT-3 5-AG CT-3,3-TC,GA-5 3-TC GA-5,MspI,5-C,CGG-3 5-C CGG-3,3GG C,C-5 3GGC C-5,Eco,RI,5-G,AATTC-3 5-G AATTC-3,3-CTTAA,G-5 3-CTTAA G-5,Aat,II,5-GACGT,C-3 5-GACGT C-3,3-C,TGCAG-5 3-C TGCAG-5,由于,限制酶,要求严格的,识别,和,切割序列,，在一段不大的,DNA,片段中，酶切位点是不多的，酶切产物片段的,大小,和,数目,也是固定的。,此特性可用于,鉴定酶种类和活性,测定，也用于鉴定,DNA,片段是否有,同源性,，或有无,变异,。,6,同裂酶,（,isoschizomer,）,定义：来源不同，能识别相同序列的限制酶。,特点：,1,）识别序列相同,2,）切割位点可能不同,同序同切酶,：识别序列和切割位点都相同。,Hind II,与,Hinc,II GTY/RAC,Hpa,II,与,HpaII,C/CGG,同序异切酶,：识别序列相同，但切割位点不同。,KpnI,GGTAC/C,Acc65I G/GTACC,7,同尾酶,(,isocaudamer,),概念：来源各异，识别的靶序列也不相同，但切割后能产生相同的黏性末端。,BamHI,G/,GATC,C,BclI,T/,GATC,A,BglII,A/,GATC,T,Sau3A /,GATC,XhoII,R/,GATC,Y,思考题：,1,限制酶的识别序列及识别位点；,2 DNA,分子酶切片段的末端类型。,