单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1、基因工程至少需要哪三种工具？,2、这三种工具分别起什么作用？,温故知新：,1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,问题1,一：,目的基因的获取,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,1.,目的基因主要是指_,编码蛋白质的基因,什么是目的基因,2、也可以是具有调控作用的因子,获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库获取,目的基因,2、利用PCR技术扩增,目的基因,3、人工合成,目的基因,已知序列,未知序列,(一)从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物,不同基因,的许多,DNA,片断，,导入,到,受体菌的群体,中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,1.基因文库概念,2.基因文库类型,基因组文库,部分基因文库,（,包含一种生物的,所有,基因,）,（包含一种生物的,一部分,基因）,基因组文库与部分基因文库的关系,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。,(一)从基因文库中获取目的基因,3.基因组文库的构建,提取某种生物的全部DNA,用适当的 限制酶,一定大小的DNA片段,将DNA片段 与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,4.cDNA文库的构建,提取某种生物的某器官或,特定,发育时期的,mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体 连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA 聚合酶,导入受体菌 中储存,反转录法：,以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,cDNA合成过程是：,第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA,互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。,第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链,降解，使之变成单链的DNA。,第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用 下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,问题2,为什么用生物发育某个时期的mRNA反转录得的DNA只有这种生物的部分基因？,某个时期的发育是,基因选择性表达,的结果,两种基因文库的主要区别如下表（课本P10）,文库类型,cDNA,文库,基因组文库,文库大小,小,大,基因中启动子,无,有,基因中内含子,无,有,基因多少,部分基因,全部基因,物种间的基因交流,可以,部分基因可以,总结,1、概念：PCR全称为_，是一项在生,物_复制_的核酸合成技术,3、条件：,2、原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,DNA,复制,(二)利用,PCR,技术,扩增目的基因,模板,（目的基因）,原料,(脱氧核苷酸),引物,（一小段单链DNA）,DNA聚合酶（耐高温）,温度控制,4、操作前提：,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。,6、结果,。,5、扩增形式：,指数形式（2,n,）,在短时间内大量扩增目的基因,7、过程：,a、变性,（90-95）：双链DNA模板在热作,用下，_断裂，形成_,b、复性,（55-60）：系统温度降低，引物与,DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸,（70-75）：在Taq酶的作用下，从,引物开始进行碱基互补配对，合成与,模板互补的_。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,(二)利用PCR技术扩增目的基因动画演示,细胞内复制,.VS.,PCR扩增,DNA母链,4种脱氧核苷酸,Taq DNA聚合酶,引物（,2个,snDNA,）,温度控制,1）模板：,2）原料：,3）酶：,DNA母链,4种脱氧核苷酸,解旋酶,DNA聚合酶,引物酶,DNA连接酶,DNA增殖,4）特点:,半保留复制,边解旋边复制,(不用DNA连接酶),半保留复制,全解旋再复制,（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因,DNA合成仪,推测,推测,合成,前提,：,基因比较小、核苷酸序列已知,蛋白质的氨基酸顺序,mRNA核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的,基因,问题4,3、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_,获取目的基因的三种方法应用,1、如果知道目的基因两端的核苷酸序列，而且基因比较大，可采用_,2、如果知道目的基因的序列，而且基因比较小，可采用_,PCR技术扩增,化学方法人工合成,从基因文库获取的方法,二：基因表达载体的构建基因工程的核心,1,目的：,使目的基因在受体细胞中,稳定存在,，并且可以,遗传给下一代,，同时使目的基因能够,表达和发挥,作用。,2,组成：,目的基因,+,启动子,+,终止子,+,标记基因,等,启动子：,位于基因的,首端,的一段特殊的DNA片断，,RNA聚合酶,识别和结合的部位,终止子：,位于基因的,尾端,的一段特殊的DNA片断，能,终止,mRNA的转录,标记基因：,鉴别,受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞,筛选,出来,3.基因表达载体的构建过程,质粒,DNA分子,限制酶处理,两个切口,四个黏性末端,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,一个切口,两个黏性末端,跟踪训练,(2012,年江苏无锡高二检测,),如图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误的是,(,),A基因工程的核心步骤是基因表达,载体构建,B任何基因表达载体的构建都是一,样的，没有差别,C图中启动子位于基因的首端，是,RNA聚合酶识别和结合的部位,D抗生素抗性基因的作用是作为标,记基因，用于鉴别受体细胞中是,否导入了目的基因,B,三、将目的基因导入受体细胞,1,转化：,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞,内维持稳定和表达的过程。,2,常用的受体细胞：,大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌,和动植物细胞等。,3,目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒,侵染,细胞的途径。,生物种类,植物细胞,动物细胞,微生物细胞,常用方法,农杆菌转化法,基因枪法,花粉通道法,显微注射法,Ca,2,处理法,受体细胞,一般是体细胞,受精卵,一般原核细胞,4,、目的基因导入受体细胞的方法,为什么动物细胞要用受精卵做受体细胞？,全能性受限制,（1）,农杆菌转化法,农杆菌特点：易感染,双,子叶植物和,裸子,植 物，对大多数,单,子叶植物没有感染能力。,原理：Ti质粒上的,T-DNA,可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,三、目的基因导入受体细胞,构建基因表达载体,转入,农杆菌,植物细胞,导入,稳定维持和表达,过程：,（2）,基因枪法,：,目的基因导入单子叶植物细胞,操作方法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法,。,钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um。,适用：,单子叶植物,基因枪法,（3）,花粉管通道法,：,将目的基因导入植物细胞,操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,特点:十分简便经济。,例：转基因抗虫棉（我国）,（4）、将目的基因导入动物细胞,方法：,显微注射法,目的基因表达载体,提纯,取卵,（受精卵）,显微注射,受精卵 新性状动物,（5）、将目的基因导入微生物细胞,微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,常用菌：大肠杆菌,常用法：,Ca,2+,处理获得感受态细胞,（改变细胞壁的通透性）,过程：,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态,细胞,感受态细胞,吸收,DNA,表达载体,与感受态,细胞混合,从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,【提示】,不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。,问题3,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少，且有的会摄入载体-载体，目的基因-目的基因类型,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,问题4,问题5,练习,采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是(),将毒素蛋白注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导人细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵,A、B、C、D、,C,检查是否成功,分子,水平,个体水平：,检测转基因生物染色体的DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交,抗原抗体杂交,四、目的基因的检测与鉴定,转基因生,物的DNA,探针,15,N,15,N,14,N,14,N,（,1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了,目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的含有目的基因DNA片段,方法,DNA分子杂交技术,变性,变性,变性,方法,分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15,N,15,N,转基因生物,的mRNA,14,N,14,N,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,苏云金杆菌,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,（4）除上述分子检测外，有时还需进行,个体生物学水平的鉴定：如抗性特性,