,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2019/12/19,#,PCR,扩增技术,DNA,聚合酶,引物,引物,M13,噬菌体,Sanger,的测序技术,引物,DNA,聚合酶,引物,引物,Mullis,的构思,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,特定,DNA,片段,94,变性,50-65,退火,XX,延伸,Taq,DNA,聚合酶（,thermus aquaticus),酶活性,(%),温度,(),40 50 60 70 80 90 100,100,80,60,40,20,72,94,55,PCR,循环,一、,PCR,的基本原理,PCR,技术实际上是,DNA,的体外扩增技术。,其原理类似于,DNA,在体内的复制过程。,只要提供一个合适的条件,模板,DNA,、寡核苷酸引物、,DNA,聚合酶、四种,dNTP,原料和合适的缓冲液体系，在一定的温度下，经过重复的过程，就可以完成,DNA,的体外合成。,PCR,反应是一个重复进行的,DNA,复制过程，需要重复进行：模板的解链、引物与模板的结合（粘合）、,DNA,聚合酶催化新链,DNA,的合成。,这些过程都是通过控制温度来实现的，即通过改变温度引起,变性（,denature,）、退火（,annealing,）和延伸（,extension,），,使,DNA,得以复制。,1,、变性,通过加热至,95,左右，使,DNA,双螺旋的氢键断裂，形成单链,DNA,，作为反应的模板。,2,、退火,将温度降至引物的,Tm,值左右或以下（比,Tm,低,5,，通常为,55,65,），引物与,DNA,模板互补结合，形成杂交链。,3,、延伸,在,DNA,聚合酶（一种耐热的,DNA,聚合酶）的作用下，于,70,74,以引物,3,端,为起始点按,53,方向使,DNA,新链延伸。,上述三步为一个循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此经过,25,30,个循环，可使新生的,DNA,片段得以扩增,10,6,9,倍（至少扩增,10,5,倍）。,PCR,的反应原理也就是,PCR,的基本过程。,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,13,步,2530,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,复性（退火）,延伸,变性,复性（退火）,延伸,变性,复性（退火）,延伸,1,）,PCR,反应成分,（,1,）模板,单、双链,DNA,均可。,不能混有蛋白酶、核酸酶、,DNA,聚合酶抑制剂、,DNA,结合蛋白类。,一般,100ng DNA,模板,/100,L,。,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,PCR,反应条件,（,2,）引物浓度,0.1-0.5 mol/L,浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。,（,3,）,Taq,DNA,聚合酶（,thermus aquaticus),0.5-2.5 U/50,l,酶量增加使反应特异性下降,;,酶量过少影响反应产量。,（,4,）,dNTP,dNTP,浓度取决于扩增片段的长度,四种,dNTP,浓度应相等,浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量,dNTP,可与,Mg,2+,结合，使游离的,Mg,2+,浓度下降，影响,DNA,聚合酶的活性。,（,5,）,Mg,2+,Mg,2+,是,DNA,聚合酶的激活剂。,0.5mmol/L-2.5mmol/L,反应体系。,Mg,2+,浓度过低会使,Taq,酶活性丧失、,PCR,产量下降；,Mg,2+,过高影响反应特异性。,Mg,2+,可与负离子结合，所以反应体系中,dNTP,、,EDTA,等的浓度影响反应中游离的,Mg,2+,浓度。,2,）循环参数,变性,使双链,DNA,解链为单链,95,o,C 20-30,秒,(2),退火,温度由引物长度和,GC,含量决定。,增加温度能减少引物与模板的非特异性结合,;,降低温度可增加反应的灵敏性。,（,3,）延伸,70-75,o,C,，,延伸时间由扩增片段长度决定,（,4,）循环次数,主要取决于模版,DNA,的浓度,一般为,25-35,次,次数过多：扩增效率降低,错误掺入率增加,http:/