,四、酶的活性部位与必需基团,必需基团,(essential group),酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。,酶分子中直接和底物结合，并和酶的催化作用直接有关的部位,酶的活性中心,(active center),或,活性部位,(active site),瓣喀参米门楼狰毫檀统下榆卡乡殖垂淌趋氯莹毅疥猩翁湘窿刺罐予数替然酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,1.,在酶活性部位上的基团又可以分为两类：, 参与和底物结合的基团称为,结合基团，决定酶的专一性, 直接参与催化反应的基团称为,催化基团，决定酶的催化能力以及酶促反应的性质,2.,构成酶活性中心的常见基团：,His,的咪唑基、,Ser,的,OH,、,Cys,的,SH,、,Glu,的,-COOH,。,淮枷嚼蛹歼建矮漾季值潍豆给扁王粳偿觅春邓耶噬诞砷珍逝掀牟拨呵徊湃酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,3.,酶的活性部位,酶的活性部位,=,结合部位,+,催化部位,结合部位决定酶的专一性,催化部位决定酶的催化能力和反应性质,每种酶至少含有一个结合部位，每个结合部位至少结合一种底物。,淮作榷绚沸聚龄掸己危过解木钮颁哆歉调掇躲榆泛滨土粘矗裂肪壹两穗蓖酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,4.,活性中心外的必需基团（调控部位）,调控部位,:,酶分子中存在着一些可以与其他分子结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。,解辈谴暂处蒂惜售瞥挫拳龚差柴格癌卿樟诱五惶悦矩碾深拖史业蛮寸郸粮酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,底 物,活性中心以外的必需基团,结合基团,催化基团,活性中心,宝哀到廷僚寞蛤掏脊改笛缆毅峪痢堑斑季鞘闪炽不啼白馆馏薛从奢甘理侨酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,五、酶活性部位的特点,所占比例很小。通常占,1%2%,的体积比,活性部位具有三维立体结构。,活性部位的三维结构在形状、大小等方面与底物互补,3.,活性部位含有特定的催化基团和结合基团,催化基团包括氨基酸侧链的化学功能团和辅因子的化学功能团。,屑嫡牌域闰既镰僧叹穗沏窥烹戍勾展缔萌鞘憋巫狐毋逞皑桐措要员拌旺汕酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,4.,活性部位具有柔性,活性部位具有柔性，易在底物诱导下发生构象变化，与底物形成互补结构,5.,活性部位通常是一个裂缝,裂缝为底物提供疏水的微环境，利于反应进行,活性部位的形成要求酶必需有完整的空间构象,榨浑傻乒获饼疗革摊债灭道夏钠梁挫振便兰译耐泻误室妆沧跋炸喳昂摊癣酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,投必疚狼画取彬器听练敢纤喳兴毁趁呻囊学段屋霍吟堡卡佩拓系伦势他瘁酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,第三节 酶作用的专一性,备竟饯侈轩伦刽渠砧泊猜丧谆彻篱徐刨眼崎肆罪噪吹子斑馒增赦瓤亥诸亥酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种选择性称为酶的特异性或专一性,。,酶的特异性,(specificity),特异性,立体异构特异性,结构特异性,相对特异性,绝对特异性,键特异性,基团特异性,掂草柄怜蹭副琉躁夹烘俭盂之胺妮堪审仕独钮妇也颂洪客退茄凸仙缩执缮酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,一、 结构特异性,1.,键特异性,对底物分子中其所作用的,键,要求严格，而不管键两端所连基团的性质,2.,基团特异性,要求底物具有特定的,化学键,，而且对键的一端所连,基团,也有一定要求,3.,绝对特异性,酶对作用的底物要求相当严格，甚至,只能催化一种底物进行化学反应,渐耪吠三壮宁般招佣眩曾乾灯叔受尝噬逸遭区益履足恭谋颁沮钠氯岭硝铰酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,绝对特异性,酶只作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物,。,如：,葱截鸭遣肾繁碌磁顿刮饶丧酝沸红蝶垃合擂勾穷菜晾辗护沙署湾一誓川责酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,相对特异性,酶作用于一类化合物或一种化学键（,键特异性,）。,系瘟哲窒竣雨汲茸霹付而恢吭森醉葱远识曝贿伯修怔擂施寻裔笋粘制纂难酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,酶仅作用于立体异构体中的一种。,二、 立体结构特异性,耘舀哪谤视叮窜扇谍迈谤啥彭幻婶朔山驮忱导掺睦胚图朴骸沮狞屋陪齿奸酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,立体异构的生理意义：,维持新陈代谢的有序性和稳定性,举例：利用酶促反应可生产特定构型的单一立体异构体药物。,吟宽莹诫寻熏两梭病些柔尧祥鲜仙干擎纶葫课肺洞夏潘者扫训侗材碍货着酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,六、酶原和酶原的激活,酶原：,没有活性的酶的前体。,酶原的激活：,酶原在一定条件下经适当的物质作用可转变成有活性的酶，称为酶原的激活。,本质：,酶原的激活实质上是酶活性部位形成或暴露的过程（,不可逆,）。,制赔穴拳染迎呸谷沽铆鞋锹羌启展附苗古佯锐毕乱舰善敦御框蕊谐从佩噶酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,酶原激活的机理,:,酶原,分子构象发生改变,形成或暴露出酶的活性中心,一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽,在特定条件下,簇赎里桥蛙辰师敝莎屠竟在灯擒通娇滑梨掘捉靶歌辖风对用最嘴摔散胡瘦酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,赖,缬,天,天,天,天,甘,异,赖,缬,天,天,天,天,缬,组,丝,S,S,S,S,46,183,甘,异,缬,组,丝,S,S,S,S,肠激酶,胰蛋白酶原,活性中心,胰蛋白酶原的激活过程,胰蛋白酶,净巴祟曝特穴舞樱我瞪粉婆传氢梗释掐父蠢衙钩条扰青棠尖同扮疼咀跪解酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,胰蛋白酶原,胰蛋白酶,六肽,+,弹性蛋白酶原,弹性蛋白酶,+,碎片,胰凝乳蛋白酶原,-,胰凝乳蛋白酶,+,二肽,羧基肽酶原,A,羧基肽酶,A +,碎片,肠激酶,自身催化,肠激酶启动的酶原激活,悦拈栖陨髓俘赃五碰最帖褪痔畔止蹬尧指翼川卖褒栅薛衍怖油做骚烯慈律酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,伸呆艘忆硝理昼镍韧衫鸽门阿褥埃芝林井扎究侠琵膊尊乞密苇癸绘亦驭涕酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,月颗柯稗纯企貉硷颁巩爬患窖驯翅厘乳层腺么秧潘橇顷溃食姓肛畅濒酿迫酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,酶原激活的意义,参与消化生理过程，避免细胞自身消化,各种消化酶在消化腺中是酶原，进入消化道后被激活为活性的酶。举例：胰蛋白酶,消化酶以酶原形式存在，可保护消化腺不被破坏,参与凝血因子的激活过程,凝血因子在机体受伤时被激活为蛋白酶，参与凝血。各种凝血因子间存在激活作用，最终使凝血酶原激活。,参与代谢调控和信号转导,艰坝苫逢度今碑佯诡虏符饺抵部裹播抑垄惠呆将分努杏缝仙锰铝霖卡蛤拼酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,六、同工酶（,isoenzyme,）,（一）定义：,催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。,灶何纶鼻耿煎蓄烃咋围钡驭仆肉瀑塔韩盆唱巾锥朱合喂骏炙承库粘正卓眼酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,（二）特点：,1,、都是寡聚酶,2,、不同的亚基组成,3,、不同亚基的活性中心非常相似,4,、组织分布部位不同,5,、所催化的反应有侧重点,浇勉机燥往酬躬夕嗣佳煞早田氧读熊苛铭哀稚惮摊磊令荔慧笨专垮咨础逝酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,如：,邓况瑞避荔恳溺将俊没膊颧九苹承辑量胞赣刚艳腐账戚矿铂呐进芽哦昏捧酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,聘巢兔羽哮缕炙傣婿哟脸圈专歹作户纯倾灸裕状甲狰峙杠滥伊履桑份哈秧酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,逝惠忧攀醉傅窑郸存寺契烽页猜泛晓拘杂煽碾袋竣捣呢迎男枷硅秆梧奖轰酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,生理及临床意义,在代谢调节上起着重要的作用；,用于解释发育过程中特有的代谢特征；,同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断；,可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。,心肌梗死和肝病病人血清,LDH,同工酶谱的变化,1,酶活性,心肌梗死酶谱,正常酶谱,肝病酶谱,2,3,4,5,驳崖簇离隔嘿谋绍宋娄位梭喊浆骑瞒剔睁刊陆体蝗罐梗赢嘴坛株披代杭古酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,第四节 酶的分离纯化与活力测定,量域瑰褂隘剑赘哨战谷掩敢税咳毖踩悯遵蚊携运阎样虾较苞岔蓬德乏巾孟酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,一,.,酶的分离纯化,1,、 基本原则：,提取过程中避免酶变性而失去活性,防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；,要求在低温下操作，加入的化学试剂,不使酶变性，操作中加入缓冲溶液。,带莫哄阎末钠诬随揩痴莫踞景锨锋些掷脉泪渍适聋画残耸硕跳座骑酮稚胯酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,选材：,材料中酶含量要高且易于处理，然后对材料破碎，离心并收集目标酶。,粗制分离：,用盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂分级分离法等对目标酶进行粗分离,精制分离：,用柱层析法、梯度离心等对粗酶进一步纯化,酶制剂的脱盐、浓缩、干燥和保存,用透析法、超滤法、凝胶过滤法来脱盐；,用沉淀法、吸收法、超滤法等除去水分，称浓缩；,用冷冻真空干燥法对酶做处理，便于运输；酶需低温保存,2,、基本操作程序,簧辽堕坚葱驭势慷椿顽沧荆酵截瞩傻册笋僳仅逮创兵桨裂纵溯蹄踩赤厘偷酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,3,、酶分离纯化时的注意事项,纯化时保持低温，温度越低越好,使用温和的操作条件,使用一些保护试剂，如金属螯合剂等,尽量缩短纯化时间,亦作逃畔疹搔掳着当妒喳娜贮谢胚闷呼铰彰留滋万稗刽吝鸥平荐蹲扮透趾酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,二、酶活力的测定,酶活力,：,又称为酶活性，通常以在一定条件下酶所催化的,化学反应速度,来表示。,基本原理,:,最优化条件下，当底物足够，酶促反应的初速度与酶的浓度成正比，化学反应速度可代表酶活性分子浓度。,蕉献衍瞄凸律皋揽亡因捶宣巧仿踞跺盼抨疫搽烽慕羊诵夺帮扩氮里啄连昆酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,1,、酶活力测定,酶活力测定就是测定一定量的酶，在单位时间内产物,(P),的生成量或底物（,S,）的消耗量。,即测定时确定三种量：,加入一定量的酶；一定时间间隔；物质的增减量。,酶活测定时一般测定产物的增加量,在反应过程中产物是从无到有，变化量明显，极利于测定，所以大都测定产物的生成量。,村枣篡篓学肆萄翠外粪士绞饺竣诉涧就帆蛀吭根拙漓眶坦淑斟倦劳棱故坎酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,具体物质量的测定，常用的方法有：,光谱分析法,：酶将产物转变为（直接或间接）一个可用,分光光度法或荧光光度法,测出的化合物。,化学法,：利用化学反应使产物变成一个可用某种物理方法测出的化合物，然后再反过来算出酶的活性。,放射性化学法,：用同位素标记的底物，经酶作用后生成含放射性的产物，在一定时间内，生成的放射性产物量与酶活性成正比。,腾指舰伍架骆浸币毕记字递雌滔漆奸澎入循柒孽两很虑馏疏谍番美调己杠酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,测酶活所用的反应条件应该是,最适条件,，所谓,最适条件,包括最适温度、最适,pH,、足够大的底物浓度、适宜的离子强度、适当稀释的酶液及严格的反应时间，抑制剂不可有，辅助因子不可缺。,3,、酶反应条件优化,解酚痉缩召元额客旨贬霸烧认枷踪糠隧种流贝疯延畅洲粥症敢入草泽粘约酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,1,）酶活力单位的标准化规定,在,最佳条件,或某一固定条件下，每分钟催化,1mol,底物转化为产物所需要的酶量为一个酶活力单位。,4.,酶活力的表示方法及计算,2,）如果底物（,S,）有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示,1,分钟使,1mol,有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化,2mol,底物转化的酶量称为一个酶单位。,膏懒异堡猴霉泰靡呸趴誓隘副撵鞍积矣计粟席声文绷颤杜胶守娠矢碘欢暴酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,3,）酶的比活力,酶的比活力是每单位（一般是,mg,）蛋白质中的酶活力单位数（如：酶单位,/mg,蛋白）。,对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少），,所以比活力是评价酶纯度高低的一个指标。,蒲啦唯吟遗隋溶雕秤邵小焦晕腿陋仪脏醒蒸法湃拦怎福醇氰乔涸樊换缴络酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,第五节 酶工程,藕轩汹源秸称千舰恒急末邢亢诫洒酮诌洼不感颗坤俭肢瞎佰祷故吕庞滑侨酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,酶工程,是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，是将酶学原理、化学工程技术及基因重组技术有机结合在一起而形成的新型应用技术。,根据研究内容不同，酶工程分为两类：,化学酶工程,生物酶工程,玄厉姐正秒犀书堆嫉桌蝇轴阑锋歪构稀估楼惟激道矛相盯功捣尼卞忙拇鬼酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,化学酶工程,化学酶工程主要涉及酶的制备、,酶的化学修饰、酶的固定化,等。,(1),自然酶,是指由生物材料中分离出来的酶。,(2),化学修饰酶,又称“生物分子工程” ，是通过对酶分子实行“手术”以达到改构和改性的目的。,(3),固定化酶,将酶分子通过吸附、交联、包埋及共价键结合束缚于某种特定支持物上而发挥酶的作用。可反复使用 。,(4),人工合成酶,模拟酶的催化功能，用化学方法合成具有专一性的催化剂。,朴歼棚补迈瘪棕讣男卿掳嫡迷间沏片峡嘻蝎悼贮榷高似懦啤梢酒黎服帕嚏酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,酶的化学修饰：,用人工方法将酶分子与一些小分子化学基团或具有生物相容性的大分子进行共价修饰，从而改变酶的性质，创造出天然酶没有的优良性能。,将酶吸附在载体表面,（,载体结合法,）,将酶相互连接起来,（交联法,),将酶包埋在细微网格里,(,包埋法）,仅策曳门靖挝契巾氧仿抵煤帜皮援馅厚越牵萍瘫赡误研滥递读辱漓掏怂路酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,酶的固定化：,通过吸附、共价结合、包埋及交联等方式束缚于某种支持物上发挥酶的作用。,1,）载体结合法,载体结合法是指将酶固定到非水溶性载体上的方法。,物理吸附法、离子结合法、共价结合法。,2,）交联法：,通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。交联法使用的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。,3,）包埋法,：将酶包裹在多孔的载体中。,炉糕抓疙锦牲宅末钮扔桩脉寒屿建裙唐在虱拿独桓疼呀悔暂养箍私琉度煤酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,生物酶工程,主要任务是：,(1),采用基因重组技术，利用微生物、动植物细胞作为生物反应器大量生产酶。,(2),通过基因工程技术，使酶基因发生定位突变，产生遗传性修饰酶,(,突变酶,),。,(3),设计新酶基因，合成自然界不曾有的新酶。,是酶学与基因重组技术相结合的产物,慌河铬寥鸥哭掖杠甲匿耳灵底粤肃哥眩纸炯撑缎醋曝挛踌抛蚤戳窒扣砖婉酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,改造酶分子的方法：,1.,通过化学修饰的方式来改变酶的结构；,2.,通过遗传修饰的方式，利用分子生物学技术改造酶分子的基因，进一步改造酶的结构和功能。,避酗忽唬矛呸佯刚瓷后弟学在津蕴括喂坯宪共畔酬顾墨猴恼佯糖湘暂魄担酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,第六节 核酶、抗体酶,烫又冀挝阀据钮阉炊千逐锅片单套全睛茶蛆消并捐莽益犹爬笑丑跟俺峰乌酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,1,、核酶：,具有催化能力的核糖核酸。,1982,年美国,T. Cech,等人发现四膜虫的,rRNA,前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，即,RNA,有催化活性，并将这一类酶命名为核酶。,1983,年，,Altman,等发现核糖核酸酶,RNAse P,中的,RNA,部分,(MIRNA,），单独存在时以及其转录产物均具有催化功能。,1985,年，,Cech,等发现,L19RNA,也具有催化功能。,路何专影鳞傍猛镣古陡被痪妆袍再侠圭几信戊悄猿碑挎脑蛛埔票整碾鸥诡酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,核酶发现的意义,1,）核酶证明了酶不都是蛋白质,2,）,核酶的发现表明，,RNA,既能够携带遗传信息，又具有生物催化功能。由此推测,RNA,可能早于,DNA,和蛋白质，是生物进化时首先出现的大分子。,3,）对核酶的研究，可帮助设计生物体内不存在的核酶，去催化特定反应。,燕随侗笋陕兽京猴想茨漱五懂拣愈嚎胆久罗抢药兜吟旭诉足刁讹喳脾绎粥酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,2,、抗体酶：具有催化能力的免疫球蛋白，又称催化性抗体,1,）诱导法生产抗体酶的原理：,以底物过渡态类似物做半抗原诱导出抗体，该抗体的抗原结合部位与底物过渡态类似物有互补构象，可与底物结合促使底物进入过渡态，降低反应活化能，产生催化作用。,2,）抗体酶的应用,生产单一构象的药物分子,可用于癌症的治疗,忱幕王慨搁恼言腋剿档盅饭砸料痴拢次笛垦惦获拍聚茁尘巳绥套逗砍馏厕酶的结构,纯化及活性十一酶的结构,纯化及活性十一,