单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 动植物细胞培养产酶,第一节 动植物细胞中酶生物合成 的调节,第二节 植物细胞培养产酶,第三节 动物细胞培养产酶,第三章 动植物细胞培养产酶 第一节 动植物细胞中酶生物合成,1,第一节 动植物细胞中酶生物合成的调节,1.细胞分化改变酶的生物合成（端粒酶）,2.基因扩增加速酶的生物合成（中国田鼠P66）,3.增强子促进酶的生物合成（胰岛素基因的增强子）,4.抗原诱导抗体酶的生物合成,抗体酶,诱导法（半抗原诱导法 酶蛋白诱导法）,第一节 动植物细胞中酶生物合成的调节1.细胞分化改变酶的生,2,第二节 植物细胞培养产酶,植物细胞培养主要产物？,色素、药物、香精、酶等。,第二节 植物细胞培养产酶植物细胞培养主要产物？,3,酶,产酶植物细胞（年份）,糖苷酶,过氧化物酶,糖化酶,木瓜蛋白酶,超氧化物岐化酶,菠萝蛋白酶,胡萝卜细胞（1981）,甜菜细胞1983，大豆细胞1989,甜菜细胞1988,番木瓜细胞1990,大蒜细胞1993,菠萝细胞1995,酶产酶植物细胞（年份）糖苷酶胡萝卜细胞（1981）,4,细胞种类,植物细胞,微生物细胞,动物细胞,细胞大小/m,20300,110,10100,倍增时间/h,12,0.30.6,15,营养要求,简单,简单,复杂,光照要求,大多要求,不要求,不要求,对剪切力的敏感性,敏感,大多数不敏感,敏感,主要产物,色素、药物、香精,醇、氨基酸、抗生素、核苷酸、有机酸、酶等,疫苗、激素、单克隆抗体、酶等,一、植物细胞的特性,细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/m20300,5,思考：植物细胞的特性？,体积大,生长速率和代谢速率比微生物低,营养要求简单,要求一定的光照时间和光照强度,对剪切力敏感，这在生物反应器的研制和培养过程通风、搅拌方面要严加控制,目的产物不同,思考：植物细胞的特性？体积大,6,二、植物细胞培养的特点,1、提高产率,实例 日本三井石油化学工业公司于1983年在世界上首次成功采用紫草细胞培养生产紫草宁，750L反应器，培养23天，细胞中紫草宁的含量达到细胞干重的14，比紫草根中紫草宁的含量高10倍。,P70,二、植物细胞培养的特点1、提高产率,7,紫草是我国传统中草药，其中的有效成分为一系列萘醌类化合物，具有凉血、活血、解毒和透疹的作用。用于子宫颈炎、外阴炎、尿布性皮炎、中耳炎、烫伤、刀伤、湿疹、水疱及其他皮肤病。紫草辅助米非司酮可提高流产成功率。具有抗垂体促性腺激素的作用，可以用于经期综合征，可以预防麻疹，有消肿作用，避孕作用。,其中紫草宁具有抗肿瘤及活性，对细胞增殖有一定的抑制作用。减少自发性乳癌的发病率，对肝癌和肺癌有一定的放射增敏作用。紫草宁可以提取红色素，紫草油以及紫草可生产紫草等紫草系列保健品。可以作为如化妆品口红、胭脂、粉饼、食品饮料、熏肉、医药胶囊、防晒制品及印染等着色剂和添加剂。,紫草是我国传统中草药，其中的有效成分为一系列萘醌类化合物，具,8,大规模细胞培养生物反应器 市场前景及经济效益分析:以年产能力50公斤紫草宁为例，国际市场价（精品干粉）每公斤价格为5000-7000美元，预计每年新增利税25-35万美元。除此之外，紫草宁因其色泽鲜艳，附着力强被国际誉为红色素之王，可作为保健食品、保健饮品、保健化妆品的添加剂。,大规模细胞培养生物反应器 市场前景及经济效,9,2、缩短周期 细胞培养倍增时间一般为1260h，一般生产周期1530d，与完整植株比较，大大缩短了生产周期。,3、易于管理，减轻劳动强度,4、提高产品质量 产物浓度较高，杂质少；污染少，易于分离纯化。,5、缺点 与微生物相比，植物细胞对剪切力敏感，生产周期长，需光照。这些会在植物细胞生物反应器的设计和工艺条件控制等方面引起一系列的问题，必须考虑和解决。,2、缩短周期 细胞培养倍增时间一般为1260h，一般生产,10,三、植物细胞培养产酶的工艺条件及其控制,（一）、工艺流程,外植体-细胞获得（直接分离、诱导愈伤组织等）-细胞培养-分离纯化-酶,三、植物细胞培养产酶的工艺条件及其控制（一）、工艺流程,11,植物细胞的获取,直接分离法,诱导愈伤组织诱导法,原生质体再生法,植物细胞的获取直接分离法,12,（二）、植物细胞培养的培养基,1、植物细胞培养基的特点,分析几种常用的植物细胞培养基，说明,植物细胞培养基的特点？,（二）、植物细胞培养的培养基1、植物细胞培养基的特点,13,植物细胞培养产酶实例,据报道，已经研究过200多种植物细胞培养，其产物超过400中。其中通过植物细胞培养产生的酶有10多种。,植物细胞培养产酶实例据报道，已经研究过200多种植物细胞培,14,阅读大蒜细胞培养生产SOD实例，说明植物细胞培养产酶工艺过程及条件控制。,阅读大蒜细胞培养生产SOD实例，说明植物细胞培养产酶工艺过程,15,SOD是催化超氧负离子进行氧化还原反应的氧化还原酶，具有抗辐射、抗氧化、抗衰老的功效。SOD可以从动物、植物和微生物细胞中提取分离得到。郭勇教授从1992年开始进行大蒜细胞培养生产超氧化物岐化酶的研究取得可喜成果。工艺过程简介如下。,SOD是催化超氧负离子进行氧化还原反应的氧化还原酶，具有抗辐,16,1、大蒜愈伤组织的诱导,选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，在4冰箱中放置3周，以打破休眠。去除外皮，先用70乙醇消毒20s，再用0.1氯化汞消毒10min，再用无菌水漂洗3次。,在无菌条件下，切成0.5cm的小块，植入含有3mg/L2，4D（2，4二氯苯氧乙酸）和1.2mg/L6-BA(苄基酰嘌呤)的半固体MS培养基中，25，600lux,12h/d光照的条件下培养18d，诱导得到愈伤组织。,1、大蒜愈伤组织的诱导,17,光照度与勒克斯：光照度是表明物体被照明程度的物理量。光照度与照明光源、被照表面及光源在空间的位置有关，大小与光源的光强和光线的入射角的余玄成正比，而与光源至被照物体表面的距离的平方成反比。光照度可用照度计直接测量。光照度的单位是勒克斯，英文lux的音译，也可写为lx。被光均匀照射的物体，在1平方米面积上所得的光通量是1流明时，它的照度是1勒克斯。有时为了充分利用光源，常在光源上附加一个反射装置，使得某些方向能够得到比较多的光通量，以增加这一方向被照面上的照度。例如摄像、摄影照明灯、手电筒和汽车前灯等都装有反光镜。,光照度与勒克斯：光照度是表明物体被照明程度的物理量。光照度,18,以下是各种环境照度值：单位 lux黑夜 0.001-0.02月夜 0.02-0.3阴天室内 5-50阴天室外 50-500晴天室内 100-1000夏季中午太阳光下的照度 约为109阅读书刊时所需的照度 50-60电视演播室所需照度 300 2000家用摄像机所需最小照度 0.3-1家用摄像机标准照度 1400,以下是各种环境照度值：单位 lux黑夜 0.001-0,19,2、大蒜细胞悬浮培养,将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织在无菌条件下转入含有3mg/L2，4D（2，4二氯苯氧乙酸）和1.2mg/L6-BA(苄基酰嘌呤)的液体培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25，600lux,12h/d光照的条件下震荡培养培养18d，使愈伤组织分散成小细胞团或单细胞。,2、大蒜细胞悬浮培养,20,然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L2，4D（2，4二氯苯氧乙酸）和1.2mg/L6-BA(苄基酰嘌呤)的液体MS培养基中，25，600lux,12h/d光照的条件下培养18d。,3、酶的分离纯化,4、细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物岐化酶。,然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/,21,第三节 动物细胞培养产酶,所谓动物细胞大规模培养技术（large-scale culture technology）是指在人工条件下（设定ph、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。,目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。,第三节 动物细胞培养产酶所谓动物细胞大规模培养技术（larg,22,已实现商业化的产品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱疮病毒疫苗、巨细胞病毒疫苗、及干扰素、血纤维蛋白溶酶原激活剂、凝血因子和、促红细胞素、松弛素、生长激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽释放酶及200种单克隆抗体等。其中，口蹄疫疫苗是动物细胞大规模培养方法生产的主要产品之一。1983年，英国Wellcome公司就已能够利用动物细胞进行大规模培养生产口蹄疫疫苗。,已实现商业化的产品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒,23,美国Genentech公司应用SV40为载体，将乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳动物细胞内进行高效表达，已生产出乙型肝炎疫苗。英国Wellcome公司采用8000L Namalwa细胞生产干扰素。英国Celltech公司用气升式生物反应器生、和干扰素；用无血清培养液在10000L气升式生物反应器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。美国Endotronic公司用中空纤维生物反应器大规模培养动物细胞生产出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生长激素等。,美国Genentech公司应用SV40为载体，将乙型肝炎病毒,24,动物细胞培养主要用于生产：疫苗、激素、多肽生长因子、酶、单克隆抗体、非抗体免疫调节剂。,白介素与机体免疫功能有关，白介素-2促进淋巴细胞分化增殖。乙型肝炎疫苗，预防乙肝。集落刺激因子，可减轻化疗时副作用，可用于爱滋病、白血病。肿瘤坏死因子，可损伤癌细胞。研制更新一代的药物和更新的应用方法，集落刺激因子和白介素的基因构建到酵母细胞中，使之产生融合蛋白质，药效增强。生产方法从利用重组DNA的微生物生产转向利用动植物来生产蛋白质类药物，构建新型多价活疫苗。,动物细胞培养主要用于生产：疫苗、激素、多肽生长因子、酶、单克,25,一、动物细胞的特性,没有细胞壁，适应环境的能力差，脆弱,体积比微生物大几千倍，但是稍小于植物细胞的体积。,在机体内相互粘连以集群形式形式存在，在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚地依赖型、接触抑制性以及功能全能性。,动物细胞的营养要求较复杂，必须供给各种氨基酸、维生素、激素和生长因子等。动物细胞培养基中一般需要加进510的血清。,一、动物细胞的特性没有细胞壁，适应环境的能力差，脆弱,26,二、动物细胞培养的特点,动物细胞培养主要用于各种功能蛋白质的生产,生长较慢，细胞倍增时间15100h,为防止微生物污染，在培养过程中，需要添加抗生素。,动物细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感，所有在培养过程中，必须严格控制温度、PH、渗透压、通风搅拌等条件，以免破坏细胞,二、动物细胞培养的特点动物细胞培养主要用于各种功能蛋白质,27,大多数细胞适宜采用贴壁培养，来自血液、淋巴组织的细胞、肿瘤细胞和杂交瘤细胞可以采用悬浮培养。,动物细胞培养基成分复杂，一般要添加血清或其代用品，产物的分离纯化过程较复杂，成本高,原代细胞培养50代后，即会退化死亡，需要重新分离细胞。,大多数细胞适宜采用贴壁培养，来自血液、淋巴组织的细胞、肿瘤,28,三、动物细胞培养方式,大部分动物细胞具有四大生物学特征：,锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面，才能生长分裂。,血清依赖性：细胞必须具有生长因子，才能生长。,接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制。,形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构。,三、动物细胞培养方式大部分动物细胞具有四大生物学特征：,29,依据在体外培养时对生长基质依赖性