单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,0,一、,DNA,序列测定的意义,二、测序技术的建立,三、,DNA,测序技术的发展,四、,DNA,测序技术的展望,五、,DNA,测序技术的应用,第1页/共45页,一、DNA序列测定的意义二、测序技术的建立三、DNA测序技术,1,DNA,的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求对,DNA,一级结构的详细了解。,一、,DNA,序列测定的意义,第2页/共45页,DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和,2,人类基因组计划（,Human Genome Project,HGP,）于,1990,年正式启动，其主要目标有：识别人类,DNA,中所有基因（超过,10,万个）；测定组成人类,DNA,的,30,亿碱基对的序列,；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。已于,2003,年完成。,人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工程，它奠定了,21,世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。,造福人类的,HGP,第3页/共45页,人类基因组计划（Human Genome Proj,3,1949,年,Frederick Sanger,开发了测定胰岛素两条肽链氨基末端序列的技术,1953,年测定了胰岛素的氨基酸序列。,1950,年,，,Edman,提出了蛋白质的,N,端测序技术,后来在此基础上发展出了蛋白质自动测序技术。,1965,年,，,Sanger,等发明了,RNA,的小片段序列测定法,并完成了大肠杆菌,5S rRNA,的,120,个核苷酸的测定。,同一时期,Holley,完成了酵母丙氨酸转运,tRNA,的序列测定。,蛋白质和,RNA,的测序技术,二、测序技术的建立,第4页/共45页,1949年,Frederick Sanger开发了测定胰岛,4,1975,年，,Sanger,和,Coulson,发明了,“,加减法,”,测定,DNA,序列。,1977,年,，,Sanger,在引入双脱氧核苷三磷酸,(ddNTP),后,形成了双脱氧链终止法,使得,DNA,序列测定的效率和准确性大大提高。,1977,年,，,Maxam,和,Gilbert,报道了化学降解法测定,DNA,的序列。,DNA,测序技术的建立,第5页/共45页,1975年，Sanger和Coulson发明了“加减法”测定,5,DNA,序列测定技术出现后,迅速超越了蛋白质和,RNA,测序技术,成为现代分子生物学中最重要的技术。,第6页/共45页,DNA序列测定技术出现后,迅速超越了蛋白质和RN,6,三、,DNA,测序技术的发展,第一代,DNA,测序技术,第二代,DNA,测序技术,第三代,DNA,测序技术,第7页/共45页,三、DNA测序技术的发展第一代DNA测序技术第7页/共45页,7,1,、第一代,DNA,测序技术,第一代,DNA,测序技术,：,传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的各种,DNA,测序技术。,第一代,DNA,测序技术包括：,化学降解法,、,双脱氧链终止法,、,荧光自动测序技术,和,杂交测序技术,。,第8页/共45页,1、第一代DNA测序技术第一代DNA测序技术：第,8,1.1,化学降解法,基本原理,:,利用特异的,选择性试剂,，专一性的随机断裂,DNA,成不同长短的片段。根据试剂的选择性及片段在高分辨力的,聚丙烯酰胺凝胶电泳,上的区带位置，判断,DNA,片段末端核苷酸的种类，从而测出,DNA,的序列。,第9页/共45页,1.1 化学降解法基本原理:第9页/共45页,9,将双链,DNA,样品变为,单链,每个单链的同一方向末端都用放射,性同位素,标记,以便显示,DNA,条带,分别用不同方法处理,获得只差,一个核苷酸的,降解,DNA,群体,电泳,读取,DNA,的核苷酸顺序,技术路线,第10页/共45页,将双链DNA样品变为单链技术路线第10页/共4,10,碱基,特异修饰方法,G,Ph8.0,用,硫酸二甲酯,对,N7,进行甲基化,使,C8-C9,键对碱基裂解有特殊敏感性,A+G,pH2.0,哌啶甲酸,可使嘌呤环的,N,原子化,从而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键,C+T,肼,可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去,C,1.5mol/L NaCl,存在时,可用,肼,除去胞嘧啶,Maxam-Gilbert,法所用的化学技术,第11页/共45页,碱基特异修饰方法GPh8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,11,第12页/共45页,第12页/共45页,12,化学降解法刚问世时，准确性较好，也容易为普通研究人员所掌握，因此用得较多。而且化学降解较之链终止法具有一个明显的优点，即所测序列来自,原,DNA,分子,而不是酶促合成产生的拷贝，排除了合成时造成的错误。但化学降解法操作过程较麻烦，且用到放射性物质，逐渐被简便快速的,Sanger,法所代替。,第13页/共45页,化学降解法刚问世时，准确性较好，也容易为普通研,13,1.2,双脱氧链终止法,又称为,Sanger,法。该法的原理是：,利用,DNA,聚合酶，以待测,单链,DNA,为模板，以,dNTP,为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的,双脱氧核苷三磷酸,（,dideoxyribo nucleoside triphos phate,，,ddNTP,）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性,聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离，,放射自显影,检测后，从凝胶底部到顶部按,53,方向读出新,合成链序列,，由此推知待测模板链的序列,。,第14页/共45页,1.2 双脱氧链终止法 又称为Sanger法。该法的,14,P,OH,dNTP,ddNTP,P,OH,OH,P,P,P,P,OH,第15页/共45页,POHdNTPddNTP POHOH P P P POH第,15,双脱氧链末端终止法测序原理示意图,第16页/共45页,双脱氧链末端终止法测序原理示意图 第16页/共45页,16,Sanger,法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种,DNA,测序技术，其中最重要的是,荧光自动测序技术,。,第17页/共45页,Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发,17,1.3,荧光自动测序技术,荧光自动测序技术基于,Sanger,原理，用,荧光标记代替同位素标记,，并用,成像系统,自动检测，从而大大提高了,DNA,测序的速度和准确性。,目前，应用最广泛的应用生物系统公司,(applied biosystems,，,ABI)3730,系列自动测序仪即是基于,毛细管电泳,和,荧光标记技术,的,DNA,测序仪,。如,ABI3730XL,测序仪拥有,96,道毛细管，,4,种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记,，在通过毛细管时不同长度的,DNA,片段上的,4,种荧光基团被激光激发，发出不同颜色的荧光，被,CCD,检测系统识别，并直接翻译成,DNA,序列。,第18页/共45页,1.3 荧光自动测序技术 荧光自动测序技术基于Sa,18,目前所用自动测序技术的改进,第19页/共45页,目前所用自动测序技术的改进第19页/共45页,19,3730,全自动测序仪,第20页/共45页,3730全自动测序仪第20页/共45页,20,1.4,杂交测序技术,该方法不同于化学降解法和,Sanger,法，是利用,DNA,杂交原理，将一系列,已知序列的单链寡核苷酸片段,固定在基片上，把待测的,DNA,样品片段变性后与其杂交，根据杂交情况排列出样品的序列信息。,杂交测序检测速度快，采用标准化的高密度,寡核苷酸芯片,能够大幅度降低检测的成本，具有部分第二代测序技术的特点。但该方法误差较大，且不能重复测定。,第21页/共45页,1.4杂交测序技术 该方法不同于化学降解法和San,21,通过几十年的逐步改进,第,1,代测序仪的读长可以超过,1000 bp,原始数据的准确率可以高达,99.999%,测定每千碱基序列的成本是,0.5,美元,每天的数据通量可以达到,600000,碱基。,第22页/共45页,通过几十年的逐步改进,第1 代测序仪的读长可以,22,第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因组计划,(human genome projec,t,HGP),主要基于第一代,DNA,测序技术。目前基于荧光标记和,Sanger,的双脱氧链终止法原理的,荧光自动测序仪,仍被广泛地应用。,随着人类基因组计划的完成,人们进入了后基因组时代,即功能基因组时代,传统的测序方法已经不能满足,深度测序,和,重复测序,等大规模基因组测序的需求,这促使了新一代,DNA,测序技术的诞生。新一代测序技术即,第二代测序技术,。,第23页/共45页,第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,23,2,、第二代,DNA,测序技术,第二代测序技术，主要包括罗氏,454,公司的,GS FLX,测序平台、,Illumina,公司的,Solexa Genome Analyzer,测序平台和,ABI,公司的,SOLiD,测序平台。,第二代测序技术最显著的特征是,高通量,一次能对几十万到几百万条,DNA,分子进行序列测序,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行,。,第24页/共45页,2、第二代DNA测序技术 第二代测序技术，主要包括,24,第二代测序技术将片段化的基因组,DNA,两侧连上接头,随后用不同的方法产生几百万个,空间固定的,PCR,克隆阵列,。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。然后进行,引物杂交,和,酶延伸反应,。由于所有的克隆都在同一平面上,这些反应就能够大规模平行进行,每个延伸反应所掺入的,荧光标记,的成像检测也能同时进行,从而获得测序数据。,DNA,序列延伸和成像检测不断重复,最后经过,计算机分析,就可以获得完整的,DNA,序列信息。,第二代测序技术包括：,454,测序技术,、,Solexa,测序技术,和,SOLiD,测序技术,。,第25页/共45页,第二代测序技术将片段化的基因组DNA两侧连上接头,25,2.1 454,测序技术,原理：在,DNA,聚合酶,、,ATP,硫酸化酶,、,荧光素酶,和,双磷酸酶,的作用下，将每一个,dNTP,的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测,DNA,序列的目的。,第26页/共45页,2.1 454测序技术 原理：在DNA,26,第27页/共45页,第27页/共45页,27,454,生命科学公司在,2005,年最早推出了第二代测序平台,Genome Sequencer 20,，并测序了支原体,Mycoplasma genitalium,的基因组。并在,2007,年推出性能更优的第二代基因组测序系统一,Genome Sequencer FLX System(GS FLX),。罗氏在,2005,年便与,454,公司洽谈并购事宜，,2007,年完成并购，紧接着公布了,DNA,双螺旋的发现者之一,沃森,(Jim Watson),的个人基因组，测序总花费不到一百万美元。,第28页/共45页,454生命科学公司在2005年最早推出了第二代测,28,2.2 Solexa,测序技术,核心技术：“,DNA,簇”和“可逆性末端终止”。,原理：将基因组,DNA,的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即,Flow cell,），这些,DNA,片段经过延伸和桥式扩增后，在,Flow cell,上形成了数以亿计,Cluster,，每个,Cluster,是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的