单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验模式动物,斑马鱼,生药学 张彩,Use Zebrafish AS A Model Organism,1,汇报内容,斑马鱼概况,斑马鱼作为模式生物的优点,斑马鱼在药物的评价中的应用,采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性毒性,2,概 况,70,年代早期，斑马鱼仅在一个研究中心被详细研究：在位于,Eugene,的 俄勒冈大学，,Charles Kimmel,及其同事开始将斑马鱼作为研究发育的动物模型，并探索其作用,。,第一部分,Chuck Kimmel,3,斑马鱼作为模式动物逐渐受到关注,Turn Eyes to Fish,Christiane,Nsslein-Volhard,1995,诺贝尔奖获得者,was able to identify and classify a small number of genes that are of key importance in determining the body plan and the formation of body segments,turned eyes to fish and find a wide range of mutations,Wolfgang,Driever,4,斑马鱼基本特性,产于热带印度，孟加拉国。,成鱼体长,4,6,厘米。体呈纺锤形。雌雄易区分。,性情温和，对水温水质要求不高，易饲养。,属卵生鱼类，,4,月龄进入性成熟期。繁殖期约,7,天左右。产卵量高，繁殖力很强。,体外受精，胚胎透明，在,24,小时内就可发育成形,，,23,天孵,出仔鱼。,5,斑马鱼的繁殖,6,斑马鱼胚胎早期发育图谱,7,斑马鱼作为模式生物的优点,1.,斑马鱼基因与人类基因的相似度达到,87%,，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视。,2.,斑马鱼的胚胎是透明的，所以生物学家很容易观察到药物对其体内器官的影响。,3.,此外，雌性斑马鱼可产卵数百枚，胚胎在,24,小时内就可发育成形，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到病因。,8,心血管系统发育,Development of Zebrafish Vascular System,Nature Medicine,1995,9,Development of Zebrafish Vascular System,28 hours,1.5 days,2,days,2.5 days,3 days,3.5,days,4.5 days,5 days,6 days,7 days,10,斑马鱼的骨骼发育,缺少,chordin,表达的斑马鱼的,BMP,蛋白水平异常，鳍和尾部骨架,也异常,注射,chordin,mRNA,后可恢复。因此研究者使用斑马鱼的这项特性来进行基因筛查，以确定脊椎动物骨骼形成的调节机制。,Rik,Derynck,Nature Genetics,1999,11,斑马鱼的心脏再生,Heart Regeneration in Zebrafish,斑马鱼的,Mps1 mitotic checkpoint,kinase,是,一个至关重要的细胞周期调节因子,，,如发生突变，则斑马鱼的心脏不能被修复而形成疤痕。因此,，,损伤诱导的斑马鱼心肌细胞增殖可以克服疤痕形成,，,使心肌再生。这个发现表明斑马鱼在分析心脏再生的分子机制方面起重要作用。,12,13 DECEMBER 2002 VOL 298 SCIENCE,心脏切除后心室肌的再生,Regeneration of ventricular myocardium,in the,resected,zebrafish,heart,13,斑马鱼在药物评价中的应用,1.,一般毒性评价,2.,发育毒性评价,3.,心血管毒性评价,4.,肝脏毒性评价,5.,神经毒性评价,6.,肾毒性评价,7.,肠胃毒性评价,8.,视觉毒性评价,9.,耳毒性评价,10.,软骨毒性评价,14,斑马鱼在药物评价中的应用,1.,一般毒性评价：在化合物的一般毒性评价可在胚胎、幼鱼、成鱼的各个阶段进行,相应的观察指标略有不同。在胚胎期,在化合物的作用下可观察终点有卵凝结、体节形成、尾部延展、心跳、色素沉着、孵化率、畸形率等。幼鱼和成鱼主要是统计,LC,50,、死亡率等。,2.,发育毒性评价：在胚胎发育和幼鱼发育过程中,很多器官系统的形成过程对药物的介人是相当敏感的,比如脑、心血管、肝脏、软骨、脊索、胰腺、肠道、肾脏,极易导致畸形的产生,是评价药物致畸性的有效模型之一。,15,斑马鱼在药物评价中的应用,3.,心血管毒性评价：心脏是斑马鱼第一个发育起来并发挥作用的器官,也是很多化合物的首要作用靶点。由于胚胎和幼鱼的透明性,无需借助遥测或其他技术就可以实时观察心跳、心脏的收缩性、血液循环,非常的便利。,4.,肝脏毒性评价：药物引起的肝损伤是制药业一个主要的毒理学问题。目前,应用斑马鱼进行的肝脏毒性评价终点主要有血清酶、肝细胞凋亡、细胞色素,P450,和组织病理学变化。,16,斑马鱼在药物评价中的应用,5.,神经毒性评价：斑马鱼胚胎在,24hpf,原代神经元细胞开始分化,48hpf,脑室形成,在,6dPf,所有的神经系统形成,斑马鱼可在短时间呈现整个神经系统,可作为一个有机载体,建立一个快速的、有效的评价药物神经毒性的平台。,6.,肾毒性评价：斑马鱼的原肾由一对肾单位、两个肾小球和前肾小管组成,较为简单。庆大霉素可引起哺乳动物肾中毒,其表型在斑马鱼原肾上也可看到,既肾小球滤过率降低。尽管结构的复杂程度不一样,但是在肾损伤表型方面却是保守的。所以以斑马鱼为肾毒性评价载体,能为药物在临床上的应用提供重要的参考价值。,17,斑马鱼在药物评价中的应用,7.,胃肠毒性评价：斑马鱼的胃肠系统和人体胃肠系统有着千差万别,斑马鱼没有胃,肠道直接开始于咽部下的一小段食道之后。在发育的早期肠道就开始蠕动,在未喂食时就自发的游走性蠕动,由于幼鱼是透明的,这些蠕动清晰可见。,8.,视觉毒性评价：斑马鱼有着与人类相似的锥形视网膜,有色彩视觉,这点超越了喜好夜间活动的啮齿类模式生物。同时,斑马鱼胚胎期视觉系统发育迅速,幼鱼就展示了视觉介导的行为,故可用于评价化合物对视觉的影响。,18,斑马鱼在药物评价中的应用,9.,耳毒性评价：斑马鱼侧线上的神经丘在结构和功能上就相当于人内耳的毛细胞。神经丘在侧线上从头至尾排列,胚胎时期在光镜下清楚可见,有助于药物作用下,观察其形态和功能变化。,10.,软骨毒性评价：斑马鱼的骨头与人类的相似,颅面骨骼都有膜内和软骨内成骨。斑马鱼也有成骨细胞核和骨细胞,并布满血管,受神经支配。,19,采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性毒性,1.,主要试剂：雷公藤甲素,(,tripto,lide,),中国医学科学院协和医科大学皮肤病研究所,(,江苏,南京,),惠赠,纯度大于,98%.,大黄素,(,emod,in),瑞雷植化制剂厂提供,含量,98%.,苦参碱,(,matrine,),江苏天晟药业有限公司产品,含量,98%.DMSO,为,S,igma,公司产品,(,美国,),。超纯水取自,M,illipore,超纯水机。,20,2.,方法：实验前一天禁食。取成体斑马鱼分别置于含有,30 50mL,溶液的瓶中,保持瓶中溶液温度恒定在,25,，随机分为空白对照,溶剂对照及各药物浓度给药组,每组含,15,条。分别给予纯净水,含不同浓度药物的纯净水。,记录不同浓度药液中斑马鱼在,24h,内的死亡数量,(,只,),计算死亡率,(%),。根据实验结果,采用,Bliss,法计算,LC,50,值,。,21,3.,结果：雷公藤甲素、苦参碱和大黄素对于斑马鱼的,LC,50,值依次为,5.02 x10,-3,、,113.2,和,1.18 x10,3,ug,/,mL,毒性大小顺序与文献报道基本一致。,22,谢谢大家！,23,