单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,基因编辑技术,CRISPR/Cas9,基因编辑技术CRISPR/Cas9,1,1987,年，日本大阪大学（,Osaka University,）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的,DNA,片段，但一直不清楚功能。后来的研究发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。,2002,年才正式命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列,CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats).,2013,年之后，研究者们在,science,和,nature,等国际著名杂志上发表多篇文章介绍,CRISPR/Cas9,系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰。,1.CRISPR/Cas,系统概述,1987年，日本大阪大学（Osaka,2,精品资料,精品资料,3,你怎么称呼老师？,如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？,你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？,教师的教鞭,“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘”,“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早”,CRISPR-Cas9-基因编辑技术简介-课件,4,已测序的接近,90%,的古细菌和,40%,的细菌的基因组或是质粒中至少存在,CRISPR,基因座。,根据,Cas,基因核心元件序列的不用，,CRISPR/Cas,免疫体统分为,3,中类型：,型、,型和,型。,型和,型,CRISPR/Cas,免疫系统需要多个,Cas,蛋白形成复合体切割,DNA,双链，而,型,CRISPR/Cas9,免疫系统只需要一个,Cas9,蛋白来切割,DNA,双链，目前,型系统是被改造的最成功的人工核酸内切酶。,1.CRISPR/Cas,系统概述,1.1CRISPR,的分布与分类：,已测序的接近90%的古细菌和40%的细菌的基,5,CRISPR/Cas,系统是很多细菌和大部分古细菌的,天然免疫系统,，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用,Cas,蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。,1.2CRISPR,系统获得：,1.CRISPR/Cas,系统概述,CRISPR/Cas系统是很多细菌和大部分,6,2.CRISPR/Cas,系统结构,2.1CRISPR/Cas,主要由两部分组成：,2.CRISPR/Cas系统结构2.1CRISPR/Cas,7,2.2CRISPR,结构：,CRISPR,是一种特殊的,DNA,重复序列家族，广泛分布于细菌和古细菌基因组中。,CRISPR,位点通常由短的高度保守的重复序列,(repeats),组成，重复序列的长度通常为,21-48bp,，重复序列之间被,26-72bp,间隔序列,(spacer),隔开。,CIRSPR,通过这些间隔序列,(spacer),与靶基因进行识别。,2.CRISPR/Cas,系统结构,2.2CRISPR结构：CRISPR是一种,8,2.3Cas,家族：,Cas(CRISPR associated),存在于,CRISPR,位点附近，是一种双链,DNA,核酸酶，能在,guide RNA,引导下对靶位点进行切割。它与,fokI,酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。,2.CRISPR/Cas,系统结构,2.3Cas家族：Cas(CRISPR as,9,CRISPR,基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）,当该噬菌体再次入侵细菌时，,CRISPR,簇首先转录为长的,crRNA,前体，然后逐步加工成小的成熟的,crRNA.,CRISPR/Cas,系统活性的发挥或外源遗传物质的干扰,crRNA,结合相关的,Cas,蛋白后，形成,crRNA-Cas,蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标,DNA,相结合，随后,Cas,蛋白对目标,DNA,进行断裂和降解。,3.CRISPR/Cas9,系统作用机制,CRISPR基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）当该噬,10,4.CRISPR/Cas9,系统,Type,因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具,-CRISPR/Cas9,。现在广泛使用的,CRISPR/Cas9,系统来源于酿脓链球菌。,Type II,系统具有以下特点：,在,CRISPR/Cas,基因座上游会表达,tracrRNA;,tracrRNA,会参与,crRNA,的加工，这个工程亦需要,RNaseIII,的参与；,tracrRNA,会与,crRNA,形成二聚体指导,Cas,对双链,DNA,的切割。,4.CRISPR/Cas9系统Type 因其简单性及可操,11,Cas9,是一种核酸内切酶,其具有：,RuvC,和,HNH,两个内切酶活性中心,Jinek,等发现,Cas9,在细菌和试管里对双链,DNA,具有强烈的切割能力,但是这种切割能力需要的,crRNA,和,tracrRNA,介导。,4.CRISPR/Cas9,系统,Cas9是一种核酸内切酶,其具有：RuvC和HNH两个内切酶,12,Jinek,等创造性的把,crRNA,和部分,tracrRNA,融合成一条嵌合的,RNA,链,使其同时具有,crRNA,和,tracrRNA,的特性,随后的切割实验表明,这条嵌合的,RNA,同样可以引导,Cas9,切割目标,DNA,。现在普遍使用的都是,crRNA,和全长,tracrRNA,融合体,简称,sgRNA(single guide RNA),4.CRISPR/Cas9,系统,Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成,13,4.CRISPR/Cas9,系统,酿脓链球菌,4.CRISPR/Cas9系统酿脓链球菌,14,4.CRISPR/Cas9,系统,4.CRISPR/Cas9系统,15,CRISPR Design Tool:,E-CRISPR:,ZiFiT:,Cas9 Design: Design Tool:E-CRISPR:,16,4.CRISPR/Cas9,系统,4.CRISPR/Cas9系统,17,基因敲除或者敲入；,基因修复；,基因调控；,文库筛选。,4.CRISPR/Cas9,系统,CRISPR/Cas,作用：,基因敲除或者敲入；基因修复；基因调控；文库筛选。4.CRIS,18,5.CRISPR/Cas9,脱靶效应,2013,年，研究者们发表多篇文章介绍,CRISPR/Cas9,系统，但,CRISPR/Cas9,目前仍存在一个很严重且无法避免的问题，即潜在的,脱靶效应,不可消除。,CRISPR/Cas9,与靶位点识别的特异性主要依赖于,gRNA,与靠近,PAM,处,10-12bp,碱基的配对，而其余远离,PAM,处,8-10bp,碱基的错配对靶位点的识别影响不大。,Cas9,蛋白,不具特异性,5.CRISPR/Cas9 脱靶效应2013年，研究者们发表,19,沈彬，2015,6.,降低脱靶效应,Cas9,切口酶,通过点突变的方法，使,Cas9,只有单链切割活性，类似于切口酶,沈彬，20156.降低脱靶效应Cas9切口酶通过点突变的方法,20,Yu Hisano,et al.,2014,6.,降低脱靶效应,添加同源臂,(homology arm,HR),Yu Hisano et al.20146.降低脱靶效应添加,21,Nicolas Wyvekens,et al,.2015,FoKI-dCas9,6.,降低脱靶效应,Nicolas Wyvekens et al.2015FoK,22,Feng Zhang,et al,.2015,6.,降低脱靶效应,CRISPR/,Cpf1,系统,Cpf1,系统更简单一些，它只需要一条,RNA,。,Cpf1,酶也比标准,SpCas9,要小，使得它更易于传送至细胞和组织内。,Cpf1,以一种不同于,Cas9,的方式切割,DNA,。,Cas9,切割留下,“平端”（,blunt ends,）,。,Cpf1,复合物生成的两条链切口是偏移的，在裸露端留下了,短悬端（,overhang,）,。这预计有助于精确插入,。,Cpf1,切口远离识别位点,。,Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System,Feng Zhang et al.20156.降低脱靶效应,23,7.,视频：基因编辑,CRISPR-Cas9,原理,7.视频：基因编辑CRISPR-Cas9原理,24,thank you,thank you,25,知识回顾,Knowledge Review,祝您成功！,知识回顾Knowledge Review祝您成功！,26,