单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,帕金森病动物模型,实验动物学：四组,组员：张鑫、赵向男、,张岩、李晓,2016.11.14,帕金森病动物模型实验动物学：四组,帕金森病,又称震颤麻痹，是一种由于脑内黑质纹状体通路,多巴胺缺乏,所致的，在老年人中常见的进行性中枢神经系统退行性疾病。,此病主要病理特征为黑质多巴胺,(DA),能神经元缺失及胞质内包涵体,-,路易小体,(Lewy body),出现,帕金森病又称震颤麻痹，是一种由于脑内黑质纹状体通路多巴胺缺乏,主要,症状,静止性震颤,肌强直,运动迟缓,体位不平衡、步态紊乱,焦虑、睡眠障碍等非运动症状,主要静止性震颤肌强直运动迟缓体位不平衡、步态紊乱焦虑、睡眠障,脊髓前角,运动神经元,调节运动功能,黑质,纹状体,DA,ACh,作用过程,脊髓前角调节运动功能黑质纹状体DAACh作用过程,正常,帕金森病,多巴胺,多巴胺,乙酰胆碱,乙酰胆碱,正常帕金森病多巴胺多巴胺乙酰胆碱乙酰胆碱,Jame Parkinson,首先在,1817,年对帕金森病的临床表现进行了描述。当时，对,PD,的发病机制几乎一无所知。直到,20,世纪,50,年代,Carlson,等对啮齿类动物注射利血平后，使动物产生类似,PD,样症状，这是最早建立的,PD,动物模型。,PD,动物模型的发展,Jame Parkinson首先在1817年对帕金森病的临床,随着对儿茶酚胺特异性神经毒素六羟基多巴胺,(6-Hydroxydopamine,，,6-OHDA),的认识，在,1968,年,Vngerstedt,等人成功地建立,6-OHDA,动物模型。之后，于,1983,年,Brundin,等报道了利用,1-,甲基,-4-,苯基,-1,2,3,6,四氢吡啶,(MPTP),制作小鼠和猴的,PD,动物模型。,随着对儿茶酚胺特异性神经毒素六羟基多巴胺(6-Hydroxy,在国内，周厚广等用两点注射法将,6-OHDA,注入大鼠一侧的黑质及内侧前脑束，成功率高达,71.1%,，电镜观察可见中脑黑质神经细胞普遍存在变性坏死及不同阶段的凋亡改变，可以较快地建立稳定地成功率较高的类似于人类中晚期帕金森病行为和病理的大鼠模型。随着研究的深入，相继出现了,NO,、,Fe,3+,及机械损伤的,PD,动物模型，根据研究目的的不同，选择不同的,PD,动物模型。,在国内，周厚广等用两点注射法将6-OHDA注入大鼠一侧的黑质,帕金森病动物模型的制备,为模拟人类,PD,，理想的动物模型应具备以下一些特点：,帕金森病动物模型的制备 为模拟人类PD，理想的动物模型应具,（,1,）多巴胺能神经元在出生时数量及形态正常，青年时期开始逐渐选择性地减少，减少量超过,50,，且容易通过神经化学和神经生理学的方法检测到；,（,2,）模型应能容易检测其运动功能的损伤，包括运动迟缓、肌僵直和静止性震颤等,PD,的主要症状；,（1）多巴胺能神经元在出生时数量及形态正常，青年时期开始逐,（,3,）模型应能显示出路易小体的形成；,（,4,）如果模型是遗传性的，应基于单一突变而使突变模型有着强大的传播能力；,（,5,）模型应有相对较短的疾病周期（如数月），以使药物筛选得以经济、快速地进行。,（3）模型应能显示出路易小体的形成；,通过在大鼠的黑质或内侧前脑束注射,6,羟多巴胺（,6-OHDA,）,通过对模型动物,(,如,:,猴、小鼠、猪等,),进行,1-,甲基,-4-,苯基,-1,2,3,6-,四氢吡啶（,MPTP,）的管饲法和立体定位注射等方法,国际通用国内应用较多是两种方法：,模型制备方法,通过在大鼠的黑质或内侧前脑束注射6羟多巴胺（6-OHDA）,前者是较精典的模型制备的方法，也是在国内较早开展的，但是由于神经元的毁损出现的较早，这与临床,PD,病人的中脑黑质多巴胺能神经元的渐进性死亡不同；,近距离的毁损很难把握毁损的程度，这使得采用这种方法获取部分损毁的模型的成功率很低；,存在的问题,前者是较精典的模型制备的方法，也是在国内较早开展的，,较之前者采用,MPTP,管饲法和立体定位注射方法，在国内最近几年才运用到帕金森动物模型的制备，国外已经利用,MPTP,在猴和小鼠身上建立了较为理想的,PD,模型，制备通常采用皮下、静脉、腹腔注射和肌肉给药，具有方法可靠且重复性较好。但是其危险性较高，对于试验人员和试验条件有着严格的要求,较之前者采用MPTP管饲法和立体定位注射方法，在国内最近几年,模型制备,应用,6-OHDA,制备偏侧,PD,鼠模型,应用,MPTP,制备,PD,动物模型,其它建模方法,模型制备应用6-OHDA制备偏侧PD鼠模型应用MPTP制备P,应用,6-OHDA,制备偏侧,PD,鼠模型,1,）雄性,Sprague-Dawley,大鼠，体重,230,250g,2,）戊巴比妥钠,(30mg/kg),麻醉后，固定于立体定向仪,3,）参照大鼠脑立体定位图谱,取两个靶点，将,12g 6-,OHDA,立体定向注射于右侧黑质,a,、,b,两个靶点,(,每点,注射量,6g,，浓度,2g,l,，溶解于含,0.1%,抗坏血酸,的生理盐水中,),。注射速度,0.3l,min,注毕留针,15min,。,应用6-OHDA制备偏侧PD鼠模型1）雄性Sprague-D,应用,MPTP,制备,PD,动物模型,灵长类,PD,模型,恒河猴戊巴比妥腹腔麻醉下，切开颈部皮肤，暴露一侧颈总动脉。将新鲜配制的,MPTP,按,1.0,1.5mg,kg,体重溶于,2mL,生理盐水中，逆血流方向缓慢注入血管中。若动物在第,1,次手术后,PD,症状不明显，分别在每隔,5d,后又给予第,2,4,次注射，直至,PD,症状出现。,应用MPTP制备PD动物模型灵长类PD模型恒河猴戊巴比妥腹腔,小鼠,PD,模型,小鼠对,MPTP,的敏感性存在种系和年龄的差异。一般选,1012,周龄，体重,2530g,成年,C57BL,褐鼠，按体重,3040 mg,kg,腹腔注射,MPTP,，连续,7d,。于第,67,次注射后出现暂时性,(23h),躯干震额、竖毛、尾巴过伸、动作减少及爬杆试验障碍,小鼠PD模型小鼠对MPTP的敏感性存在种系和年龄的差异。一般,利血平主要可以通过抑制去甲肾上腺素能神经元末梢的再摄取功能，使囊泡内贮存的多巴胺,(DA),及其他的儿茶酚胺类递质耗竭。将雄性,Wistar,大鼠,(,体重,280300g),腹腔内注射一定剂量的利血平后可使其出现骨伤肌慢硬、震颤、身体屈曲、运动过少以及其他的一些运动症状。神经化学分析发现大鼠纹状体内,DA,和其他单胺类递质的含量明显减少,利血平模型,其它建模方法,利血平主要可以通过抑制去甲肾上腺素能神经元末梢的再摄取功能，,它存在明显的不足：一是药物注射造成的运动障碍在不同时间和不同个体之间变异性较大；二是利血乎同时引起了多种递质释放并且无法造成类似,PD,的病理改变。因此该模型的应用只局限于探索药物影响肌僵状态的实验中，对其他的运动症状的研究现已很少应用,它存在明显的不足：一是药物注射造成的运动障碍在不同时间和不同,1991,年,Ben-Shachar,在雄性,SD,大鼠,(250300g),单侧黑质内注射,Fe,3+,三周后可使其出现明显的运动行为改变，表现为在新环境中自主运动减少，短暂的僵直症状及自发的同测旋转行为。,Fe,3+,模型,1991年Ben-Shachar在雄性SD大鼠(25030,研究发现机械损伤内侧前肋束,(MF,可以造成黑质内的,DA,能神经元进行性死亡。已经建立的造模方法有,MFB,独突切断术和中脑半切术，尤以前者应用较多。,机械损伤模型,研究发现机械损伤内侧前肋束(MF可以造成黑质内的DA能神经元,用该方法造模有如下优点：,成功率高，较为经济。,黑质,DA,能神经元呈现渐进性死亡，可以模拟,PD,病理变化的全过程，对于研究神经元的再生和,PD,的预防有一定的意义。,缺点是切断术后短时间内，损伤的程度不稳定。,用该方法造模有如下优点：,6-OHDA,大鼠模型：,在注射,6-OHDA,后连续,6,周进行行为学检测，用阿朴吗啡腹腔注射，,1,5,分钟后出现旋转,旋转时以健侧后肢为支点,身体向健侧弯曲,首尾相接,原地转动。有的甚至出现翻转,有的呈小环行旋转，速度,7r/min,视为成功模型。通过旋转记录仪计算一定时间内旋转的总次数，可以粗略估计大鼠脑内,DA,能神经元的死亡程度。,动物模型的评价,行为学测试,6-OHDA大鼠模型：动物模型的评价行为学测试,MPTP,致灵长类,PD,模型：,腹腔注射或静脉注射,MPTP,第,2,天，动物即出现自发性运动减少，呈进行性加重，以至于运动不能，弓背姿势，四肢紧张性弯曲，肌强直伴震颤，吞咽困难，不能进食及发音减弱。,MPTP致灵长类PD模型：,MPTP,小鼠模型：,爬杆实验：将一直径为,25cm,的软木小球固定于一根长,50cm,、粗,1cm,的木杆顶部,木杆上缠上纱布以防打滑，然后将被测小鼠放到小球上，并记录以下时间：小鼠从小球上下来所需的时间，小鼠爬完秆子的上半部和下半部所需的时间。,MPTP小鼠模型：,游泳实验：将受试小鼠放入一个,20,3020cm,的水箱中，水温为,22,25,。若在受试时间内能连续不断的游泳者记,3,分，大部分时间游泳仅偶尔漂浮者记,2.5,分，漂浮时间占整个受试时间,50%,以上者记,2.0,分，偶尔游泳者记,0.5,分，偶尔用后肢游动并漂浮在一起者记,1.0,分。以正常小鼠作为对照，最后计算得分情况，并作统计学分析。,游泳实验：将受试小鼠放入一个203020,将,PD,动物麻醉后，用,0.9%,盐水和,4%,多聚甲醛灌注固定，连续冰冻切片，行酪氨酸羟化酶免疫组织化学染色。毁损一侧黑质和腹侧背盖区的,TH,阳性神经元明显消失，而同一脑片健侧可见大量,TH,阳性神经元。,形态学评价,将PD动物麻醉后，用0.9%盐水和4%多聚甲醛灌注固定，连续,利用高效液相,2,电化学法测定,PD,模型黑质及纹状体中多巴胺及其代谢产物高香草酸,(HVA),含量，结果发现各种动物模型毁损侧黑质、纹状体内,DA,、,HVA,含量均显著降低。,神经生化改变,利用高效液相2电化学法测定PD模型黑质及纹状体中多巴胺及其代,治疗,金刚烷胺,左旋多巴,抗胆碱能,药物,多巴胺受体,激动剂,治疗金刚烷胺左旋多巴抗胆碱能多巴胺受体,抗胆碱能药物,药物：东莨菪碱、盐酸苯海索,作用：,1,、能维持纹状体的递质平衡,2,、对震颤和肌强直有效,抗胆碱能药物药物：东莨菪碱、盐酸苯海索作用：1、能维持纹状体,金刚烷胺,1,、促进神经末梢释放多巴胺，并阻止,其再摄取；,2,、能改善震颤、肌强直和运动迟缓等,症状。,金刚烷胺1、促进神经末梢释放多巴胺，并阻止,左旋多巴制剂,左旋多巴合并多巴脱羧酶抑制剂是目前最有效的药物。,对各期病人都有效，但一般主张病人出现姿势平衡障碍或工作受到影响时使用，它对运动迟缓和肌强直疗效好，对震颤亦有效。,左旋多巴制剂 左旋多巴合并多巴脱羧酶抑制剂是目前最有效,多巴胺受体激动剂,1,、早期：可延缓多巴胺代替药物的使,用；,2,、中晚期：改善症状，并减少替代药,物的用量。,多巴胺受体激动剂1、早期：可延缓多巴胺代替药物的使,随着对,PD,的发病机制研究的不断深入，目前，已有学者应用,PD,患者血清,IgG,、脂多糖,(LPS),、铁离子,(Fe,3+,),、,32,氮基酪氨酸注射于单侧黑质来建立偏侧,PD,大鼠模型。,VanderPutten,等已成功地制备了,-,synuclein,转基因小鼠和转基因果蝇，高表达人类,-,synuclein,的转基因小鼠具有,PD,的部分特征。总之，目前建立的,PD,动物模型都是使动物在短时间内出现帕金森病的症状或病理变化，很难模仿帕金森病这一神经系统的慢性疾病的自然进程。因此，获得一种更为理想的帕金森病动物模型，将更有利于对帕金森病的发病机制及实验治疗进行深入研究。,机遇与挑战,随着对PD的发病机制研究的不断深入，目前，已有学者应用PD患,除上述模型