,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第十三章分子生物学技术,第一节、重组DNA技术-基因工程,第二节、分子杂交及相关技术,第三节、聚合酶链反应的原理和应用,第四节、基因定位的常用方法,1,分子生物学技术,70年代以来,分子生物学技术迅速发展起来,使人们有可能进行人类基因组及单个基因的结构研究,分析其功能特征,了解其变化规律。分子生物学技术为揭示人类遗传病的本质起着重要作用。下面就一些分子生物学技术予以介绍。,2,1946 1950 1955 1960 1965,1970 1975 1980 1985 1990 1995,1944DNA是遗传物质,1949Hbs贫血,1953双螺旋,1956HbsGlu-Val,1966遗传密码,第一个R酶,1972重组质粒,1975DNA杂交,1977DNA测序,1981转G小鼠,1983HD病G定位,1985PCR,1986位置克隆,1987G剔除小鼠,1989位置克隆,1990第一个基因治疗,1995细菌G组序列,1996酵母基因组序列,现代分子遗传学发展,重要事件,3,第一节 重组DNA技术-基因工程,重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。,重组DNA技术（,Recombinant DNA Technique,）,是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。,这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。,4,一、限制酶,限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。,发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。,5,1、限制酶的命名,根据其来源命名。如：,属名 菌株名,E,co,R I,种名 编号,EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。,6,2、限制酶识别序列和切割形成,每种限制酶能识别和切割的通常48个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。,如：Hare 5-GGCC-3,Bam HI 5-GGATCC-3,平末端(blunt end)对称轴切，连接效果差,切割形成 粘性末端（sticky end）交错切。,7,8,部分常用限制酶及切点,9,互补末端连接,10,产生相同序列的突出末端的不同片段可有三种方式：,1)用同一种限制酶切割；,2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割；,3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。,11,3、特点：,根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途：,1)不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。,2)用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。,3)Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。,12,二、基因运载体及其选择,载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。,13,载体具以下特征,：,1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；,2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；,3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。,常用的载体有,：质粒，噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等。,14,（一）.质粒plasmid,Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。,PBR322,大肠杆菌,pSC101,Plasmid chromosome,COIEI,plasmid,革兰氏阴性菌,pc194,scp12,真核生物-酵母质粒,15,常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。,EcoRI,HindIII,Ori复制起点,LacZ,AP,R,pUC19,16,（二）.-噬菌体(phage),是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌.-噬菌体DNA是线状双链DNA分子,全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。,改建后的噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：,17,1、置换载体 溶解途径,载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。,2、插入载体 裂解途径,DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。,18,裂解途径,19,（,三）.粘粒(cosmid vector)（3040kb）,是将质粒和噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid 而得名Cosmid。改建后的粘粒含有噬菌体的复制起点和cos 末端。全长8kb。大片段外源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装3045kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。,20,(四)大片段DNA克隆载体,人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：DMD gene 2300kb），克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：BAC，PI，YAC等。,21,1、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）,优点：能携带大片段DNA，约300kb。,在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。,缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，E coli中的F因子。此质粒含有2种基因（part A,part B）。每个E coli能接受 300kbDNA片段。,22,2、噬菌体PI载体和PAC,PI噬菌体与噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（110115kb）线性DNA，并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细胞后环化，扩增。,1994年，有人将PI和F因子克隆结合产生PI人工染色体克隆系统-PAC。,23,3、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）,适用于克隆大片段DNA，0.22Mb。,24,YAC 的主要功能成份有三：,1,）,着丝粒,：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。,2）,端粒：,保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。,3）,自主复制序列（ARS）元件,：是染色体自主复制的复制起点。,构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。,25,三、DNA重组与分子克隆化,为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的DNA片段，,称为DNA克隆，亦称分子克隆。,26,基本原理与过程：,1、分离纯化目的基因,2、目的基因+vector=重组DNA分子,3、重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。,4、筛选含有重组DNA的细胞细胞克隆（cell clone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。,5、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。,27,分离纯化目的基因目的基因+vector=重组DNA分子,28,重组DNA,和,分子,克隆,29,重组DNA和分子克隆的几种方法：,（,依目的基因的来源,）,1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆,2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行,克隆,3、化学合成目的基因进行克隆,4、PCR体外扩增目的片段进行克隆,30,从基因组中分离目的基因在细胞中克隆,31,筛选含有重组DNA的细胞细胞克隆（cell clone）,32,筛查含有目的基因的细胞克隆,33,四、目的基因表达,上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。,重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物RNA，蛋白质。,就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。（expression cloning）.,34,目的基因表达,35,（一）真核细胞的基因在原核细胞（细菌）中表达,原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆,菌为宿主。,真核多肽的表达要求：,1）适当的cDNA（完整的编码序列）；,2）适当的表达载体，提供特定多肽信息；,3）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。,产物特征：,1）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定；,2）活性受限或无活性。,36,(二)、真核细胞基因在真核细胞中表达,真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。,应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究特定基因的表达。,产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋白的稳定和功能活性。,37,五,、基因文库,基因文库（gene library）,应用DNA重组技术构建的含有基因组的全部基因的DNA克隆。,38,（,一）构建基因组DNA文库,39,（,二）染色体特异的基因文库 （chromosome specific library）,单个染色体 细胞克隆,（流式C仪）,细胞 染色体,染色体文库,染色体区带 区带特异,（显微切割）,DNA文库,40,（三）cDNA文库（cDNA library）,cDNA文库构建：,特定组织细胞一定发育阶段 总 mRNA,41,树立质量法制观念、提高全员质量意识。,11月-24,11月-24,Saturday,November 16,2024,人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。,19:27:31,19:27:31,19:27,11/16/2024 7:27:31 PM,安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦绷。,11月-24,19:27:31,19:27,Nov-24,16-Nov-24,加强交通建设管理，确保工程建设质量。,19:27:31,19:27:31,19:27,Saturday,November 16,2024,安全在于心细，事故出在麻痹。,11月-24,11月-24,19:27:31,19:27:31,November 16,2024,踏实肯干，努力奋斗。,2024年11月16日,7:27 下午,11月-24,11月-24,追求至善凭技术开拓市场，凭管理增创效益，凭服务树立形象。,16 十一月 2024,7:27:31 下午,19:27:31,11月-24,严格把控质量关，让生产更加有保障。,十一月 24,7:27 下午,11月-24,19:27,November 16,2024,作业标准记得牢，驾轻就熟除烦恼。,2024/11/16 19:27:31,19:27:31,16 November 2024,好的事情马上就会到来，一切都是最好的安排。,7:27:31 下午,7:27 下午,19:27:31,11月-24,一马当先，全员举绩，梅开二度，业绩保底。,11月-24,11月-24,19:27,19:27:31,19:27:31,Nov-24,牢记安全之责，善谋安全之策，力务安全之实。,2024/11/16 19:27:31,Saturday,November 16,2024,相信相信得力量。,11月-24,2024/11/