单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,细胞核的分离与核酸的鉴定,细胞核的分离与核酸的鉴定,第1页,1.,掌握离心技术原理及离心机使用；,2.,熟悉提取分离细胞核、细胞质方法；,3.,熟悉判定核酸方法；,细胞核的分离与核酸的鉴定,第2页,一、分离细胞质与细胞核,.,破碎细胞,细胞破碎方法,机械法,高速组织捣碎机,玻璃匀浆器,研钵,物理法,超声匀浆器,冻融法,化学法,自溶法,酶处理,表面活性剂处理法,细胞核的分离与核酸的鉴定,第3页,细胞核的分离与核酸的鉴定,第4页,利用各细胞器在一定介质中,沉降速度差异,，可采取离心方法，将细胞器分离出来。,.,离心技术,细胞器沉降先后次序先后是细胞核、线粒,体、溶酶体和其它微体、核糖体和大分子。,细胞核的分离与核酸的鉴定,第5页,离 心 方 法,差速沉降离心法,速率区带离心法,等密度区带离心法,密度梯度区带离心法,细胞核的分离与核酸的鉴定,第6页,差速沉降离心法,(differential centrifugation),采取逐步增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不一样颗粒，在不一样离心速度及不一样离心时间下分批分离方法。,加速,低速,高速,细胞核的分离与核酸的鉴定,第7页,差速沉降离心法普通用于分离沉降速度相,差较大（普通为,10,倍）颗粒。,缺点：,分离效果差，不能一次得到纯颗粒；,壁效应严重，尤其是当颗粒很大或浓度很高 时，在离心管一侧会出现沉淀；,颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗 粒变形、聚集而失活。,细胞核的分离与核酸的鉴定,第8页,每种纯样品成份在介质溶液中沉降速度能够表为：,V=d,2,18(-s),2,r,。,V,：是某一时刻样品沉降速度（厘米,/,秒）；,d,：样品颗粒直径（厘米）；,：样品颗粒密度（克,/,厘米,3,）；,s,：介质溶液密度（克,/,厘米,3,）；,：介质溶液粘性系数（克,/,厘米,秒）；,：离心机重轴旋转角速度（,1/,秒），,=2N60,，,N,：转,/,分；,r,：颗粒所在位置与旋转轴心之间距离，即离心半径（厘米）；,密度梯度离心法理论依据,细胞核的分离与核酸的鉴定,第9页,待分样品沉浮行为怎样确定？,当,S,时,V0,即样品顺离心力方向沉降,S,时,V0,即样品逆离心力方向上浮,=S,时,V=0,即样品停顿沉降或上浮，“稳定”在这一位置用这个公式能够很好地解释在速率区带离心法或等密度区带离心法中单一样品沉降（或上浮）行为。,细胞核的分离与核酸的鉴定,第10页,速率区带离心法,人为地加入不一样密度活性物质，形成一个较为平缓介质梯度，将样品加在介质中进行离心，在一定离心力下依据颗粒沉降速度不一样最终分配到梯度中一些特定位置上，形成不一样区带分离方法。,此法用于分离含有一定沉降速度差颗粒,（,沉降速度差为,20%,或更少）,或分子量相差,3,倍蛋白质,。,适合用于分离密度相同而大小有别样品。,细胞核的分离与核酸的鉴定,第11页,样品在密度较高、密度梯度较为陡峭介质溶液中进行离心，含有不一样密度颗粒向上浮起，一直移动到与它们密度相等等密度点特定梯度位置上，形成几条不一样区带，这就是,等密度区带离心法。,等密度区带离心法,此方法适合用于分离大小相近而密度不一样样品。,细胞核的分离与核酸的鉴定,第12页,优点：,a.,分离效果好，可一次取得较纯颗粒。,b.,适应范围广,能象差速离心法一样分离含有沉降 系数差颗粒,又能分离有一定浮力密度差颗粒。,c.,颗粒不会挤压变形。,缺点：,a.,离心时间较长；,b.,需要制备梯度；操作严格，不易掌握。,密度梯度区带离心法,(,density gradient centrifugation),细胞核的分离与核酸的鉴定,第13页,1,、核酸种类及其分布,请思索？,DNA,、,RNA,在细胞中分布：,DNA,胞核内,(98%),胞质内,(2%),RNA,胞核内,(10%),胞质内,(90%),核酸种类：,DNA,、,RNA,结论：,DNA,主要存在于细胞核，,RNA,主要存在于细胞质。,二、核酸判定,细胞核的分离与核酸的鉴定,第14页,2,、核酸水解,核 酸,核苷酸,磷 酸,碱 基,戊 糖,定糖法（戊糖差异）,细胞核的分离与核酸的鉴定,第15页,（,1,）核糖核酸判定,浓,HCl,3H,2,O,+,D,核糖,糠醛,糠醛,3,，,5,二羟基甲苯,绿色化合物,RNA,水解,D,核糖,细胞核的分离与核酸的鉴定,第16页,（,2,）脱氧核糖核酸判定,DNA,水解,D,脱氧核糖,-H,2,O,硫酸,脱氧核糖,羟基,酮基戊醛,蓝色化合物,细胞核的分离与核酸的鉴定,第17页,（,1,）分离细胞质与细胞核,（,1,）分离细胞质与细胞核,（,2,）核酸判定,细胞核的分离与核酸的鉴定,第18页,0.5g,肝组织,少许石英砂,研磨,加,5ml,1.5%,柠檬酸溶液，研磨，双层纱布过滤,肝匀浆，倾入离心管,离心：,3000r/min,；,10,上层液,沉淀,加入,1ml 0.25mol/L,蔗糖柠檬酸溶液,核悬液,沿壁缓铺于,8ml,0.88mol/L,蔗糖柠檬酸液面上,离心：,r/min,；,5,上层液（弃去）,沉淀,核洗液,5ml,洗涤沉淀，离心：,r/min,，,5,上层液（弃去）,沉 淀,初步纯化细胞核,5ml 0.02mol/L NaOH,溶解细胞核,待测样品,判定,实 验 流 程 图,细胞核的分离与核酸的鉴定,第19页,编 号,1,2,细胞质（滴）,20,-,核液（滴）,-,20,1mol/LKOH,（滴）,20,20,2,判定：取试管三支，编号，按下表操作,:,编号,1,2,3,细胞质水解液（滴）,20,-,-,核液水解液（滴）,-,20,-,5,三氯醋酸（滴）,10,10,30,3,5,一二羟基甲苯液（滴）,30,30,30,1.,水解：取离心管二支，编号，按下表操作,：,（,2,）核糖核酸判定,混合各管,沸水浴,(10,),冷却,加入,5%,三氯醋酸,(8ml),搅匀后离心,r/min,；,5,上清液,马上混合各管,沸水浴,(10,),冷却,比较各管颜色,细胞核的分离与核酸的鉴定,第20页,2,判定：取试管三支，编号，按下表操作,:,1.,水解：取离心管二支，编号，按下表操作,：,编号,1,2,细胞质（滴）,20,-,核液（滴）,-,20,1mol/L,过氯酸,(,滴）,20,20,编号,1,2,3,细胞质水解液（滴）,20,-,-,核水解液（滴）,-,20,-,1mol/L,过氯酸（滴）,20,二苯胺试剂（滴）,20,20,20,（,3,）脱氧核糖核酸判定,混合各管,冷却,离心,上清液,马上混合各管,冷却,比较各管颜色,r/min;5,细胞核的分离与核酸的鉴定,第21页,表,1.,核糖核酸判定,试管编号,1,2,3,现象,试管编号,1,2,3,现象,表,2.,脱氧核糖核酸判定,细胞核的分离与核酸的鉴定,第22页,1,规范操作，预防滴管、试剂污染。,细核悬液平铺要轻柔；,浓酸取用要小心；,使用离心机注意平衡，转速从低到高；,细胞核的分离与核酸的鉴定,第23页,思 考,1.,本试验结束后若想继续测定肝脏中,DNA,、,RNA,含 量，可用什么方法？,2.,咱们已经学习了电泳法和层析法来分离蛋白质，请问 咱们是否能够用这两种方法分离,DNA,、,RNA,？若能，请简单叙述其原理。,细胞核的分离与核酸的鉴定,第24页,试验七 血糖测定（葡萄糖氧化酶,-,过氧化物酶法）及肾上腺素对血糖浓度影响,1.,血糖起源与去路？,2.,激素对血糖调整？,3.,什么是高血糖、低血糖，尿糖？,4.,试验原理及操作步骤。,下次试验预习内容,细胞核的分离与核酸的鉴定,第25页,