*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,免疫电泳, 魔天记,免疫电泳的各种方法是电泳和免疫沉淀的结合应用。通过这种技术，可以对复杂样品如血清、细菌裂解液中的抗原进行定量和定性的分析。浓度为1-2%的琼脂糖凝胶可以作为电泳和沉淀的基质。例如pH值范围在6-9的硼酸盐溶液可以用作反应的缓冲液体系。必须要注意缓冲液的离子浓度不能太高，另外，电泳对温度的变化也是很敏感的。同时我们也要避免凝胶的融化以及蛋白的变性，因为这有可能会使其失去抗原性。,7.1.4.1简单免疫电泳,简单免疫电泳只追求单纯的定性分析。它尤其适用于在复杂样品中同时检测多种抗原。对抗原的分离是基于其电荷的差异，因此该技术提供了更好的解决方法。因为抗原在免疫电泳的过程中扩散占用了较大的空间，所以它的灵敏性不是太高。,将抗原溶液加入到加样槽中，在电流作用下电泳分离过程就开始了。根据分子所带净电荷的不同，分子量大小的差异，在琼脂糖凝胶中进行电泳时分子的迁移速率和方向也不同，这样电泳就会将不同抗原分子在琼脂糖凝胶中分离成若干区带。然后与电泳方向平行挖一小槽，加入抗血清（含抗体），通过免疫扩散，抗体与已经分离的抗原在琼脂糖凝胶中双向扩散，二者特异性结合在比例合适处形成弧形沉淀线。,和琼脂平板法相似，简单免疫电泳的各种沉淀线也代表着抗原的同一性、部分同一性和非同一性。如果电泳分离的两抗原其沉淀线距离很远相互没有接触，那电泳的时间就要减少一下了。,如果要验证一个已知抗原的话，可以将样品和参考标准抗原平行加样进行电泳。然后将抗血清加入到两者之间的加样槽中进行免疫扩散即可。,7.1.4.2交叉免疫电泳,交叉免疫电泳是简单免疫电泳的一种提高。相似的，样品中的抗原依据电荷不同经电泳后被分离，然后使已经分开的抗原成分与原电泳方向呈90角的方向在含有抗体的琼脂糖凝胶中进行二向电泳。抗原和抗体根据各自所带电荷的不同在胶中进行迁移。,由于大多数抗体的等电点大约为中性pH值范围，因此利用中性缓冲液体系进行电泳时，抗体分子不动或者移动很小。因为抗原在胶中的迁移是根据其带的净电荷，所以它们的等电点必须与缓冲液体系的pH值有较大的差异。如果这些条件都满足了，如带负电的抗原其与抗体结合的沉淀线便会在适当的区域产生并快速向正极移动（形成逐渐向正极移动的沉淀峰）。除非再也没有抗原可以进行扩散，这时沉淀峰的移动才会停止。,利用胶中连续的抗体浓度，峰的最大高度是和提供的抗原的浓度呈比例的。根据已知浓度的各种标准抗原，交叉免疫电泳可以定性和定量的分析抗原。,除了可以进行定量分析，交叉免疫电泳相对于简单免疫电泳仍有很多的优势：它提供了更好的解决方案，并且可以明显的快速进行。第一向分离抗原的电泳大约需要3小时，而接下来的扩散需要30-90分钟就可以了。,7.1.4.3火箭免疫电泳,火箭免疫电泳只追求对抗原进行定量分析。可以精确、简单、快速的定量分析0.5-2g的抗原。,在这个过程中，我们在1-2%的琼脂糖凝胶中（厚约1.5mm）打上几个大约3-8mm长的小洞，待测样品和稀释不同程度的标准抗原被加入这样的小洞以建立标准曲线。和交叉免疫电泳的第二步类似，抗原在含有抗体的胶中进行电泳，很快火箭样的沉淀线形成并向着电极的方向移动直到稳定下来。,在抗体浓度恒定的胶中沉淀线的最大的迁移距离和抗原浓度的关系是线性的。由已知浓度的标准抗原溶液可以得到标准曲线，沉淀线的迁移距离和凝胶中抗血清的浓度是成反比的。因此降低胶中抗血清的浓度可以增加该方法的敏感性。,只有在抗原和抗体具有不同的等电点并且伴随不同的迁移速率，火箭电泳才能进行。如果不满足这个条件，可以由氨甲酰化抗原来降低其等电点，方法是这样的：,一体积抗原溶液和一体积KCNO(2mM)在45孵育30min。待冷却以后，该混合液用电泳缓冲液调整到要求的浓度，然后加入到胶中即可。,7.1.5其局限性及其重要性,经典的免疫沉淀的方法已经从实验室里逐渐的消失了。简单免疫电泳基本被Western Blot方法所替代，定量分析方法比如放射免疫扩散、火箭免疫电泳越来越多的被更灵敏的方法如ELISA、RIA所代替了。主要原因除了其灵敏性低，还有一个原因就是其反应时间较长。,如果实验对敏感性没有特殊的要求，并且如果不是要检测半抗原，可以考虑这些经典免疫沉淀方法。它们操作简单，并且不会造成大量的物质消耗，不需要昂贵的ELISA等仪器。,7.2当今的免疫沉淀,免疫沉淀现在更多的被用作一种分析方法。利用该技术，细胞大家族里面的某些特定抗原能够被检测出来。,另外，单克隆抗体的抗原特异性也可以用免疫沉淀的方法来测得。利用现代免疫技术，不需要考虑抗原表位与抗体互补位间的平衡，而这在传统方法里是相当重要的。抗体通常被加到过量的抗原中。另外单克隆抗体也可以用此方法。因为抗体被交联到了一个固定相上，如琼脂糖凝胶，免疫沉淀复合物可以通过简单的离心而分离，然后便可以对其进行分析。,7.2.1沉淀基质,我们用什么来沉淀复合物呢？在免疫学的研究中，经常会用到IgG与细菌蛋白A、蛋白G的特异性结合。这些细菌蛋白目前已经商品化用作与琼脂糖凝胶结合。它们非常好用，因为只需要电泳就可以完成免疫电泳。IgG分子与这些蛋白的结合是通过其Fc端，因此其抗原结合位点都是可用的。这种方法在灵敏性及检测量上都有很明显的提高。将琼脂糖凝胶提前活化了，例如抗小鼠IgG琼脂糖凝胶以及EupergitC1Z就是很好的例子。,由于磁珠的普遍应用，现在不再依赖于各种不同的琼脂糖凝胶了，越来越多的人开始利用蛋白A和蛋白G的磁珠，或者预活化的磁珠。在这些方法的帮助下，利用一个磁化的平台，所需免疫复合物可以很轻松的从样品中分离出来。,Brymora等人在2001年发明将沉淀基质加入到一个旋转的柱子中，这样可以减少基质在漂洗过程中的流失，使得免疫沉淀基质可以多次复利用。,如果要节省开支的话，这里还有一点好的建议。因为使用各种各样的蛋白A和蛋白G确实不太经济，可以从staph A 中分离出非活化的固定细胞来用，这是最原始的沉淀基质。它的缺点是用staph A来做基质的时候会有更多的非特异性蛋白沉淀。,7.2.2减少非特异性沉淀蛋白,免疫沉淀的过程似乎很简单：首先将抗原特异性抗体加入到沉淀基质中，然后将此体系与样品（待测抗原）共孵育，最好将反应产物离心即可。但是在分析沉淀抗原时，我们经常会得到很不理想的结果，一些非特异性沉淀的蛋白会影响到结果的分析，或者从结果中得不出任何的结论。下面是一点建议：,一种可能的污染是，蛋白和沉淀基质的非特异性连接，和琼脂糖凝胶、磁珠、蛋白A或蛋白G等。当将样品和不含任何抗体的基质提前共孵育一段时间后再用的话，这种背景就会被减少了；将含有结合蛋白的基质换掉，然后将其与新鲜的含有抗体的基质共孵育，也可以消除这种干扰。,当然，蛋白也可能会非特异性的结合到抗体上，或者它们具有和抗原表位相似的结构，也可以结合到抗体的互补位上。它们的这种结合力通常会比正确的抗原-抗体结合力弱。通过将非离子型去垢剂（如Triton X-100,NP-40,，,Tween-20,）和NaCl加入到缓冲液中，这种弱的结合力会被降低到最小。非离子型去垢剂（1-10%）是通过降低它们之间的疏水作用来起作用的，而加入NaCl是为了减少静电作用。,Doolittle 等发明用两级免疫沉淀法，用SDS来减少非特异性沉淀蛋白的干扰。在第一次沉淀过程结束后，免疫沉淀物用SDS变性。在加入新鲜沉淀基质之前SDS的作用用Triton X-100来覆盖。这样的预处理是为了将抗体和变性的抗原结合进行二次沉淀。如果用多克隆抗血清的话一般不会有什么问题了。尿素、氯化镁以及氢氧化钠都可以用来减少非特异性沉淀蛋白的出现。,如果来自细胞裂解液的抗原要进行免疫沉淀，胞质中的蛋白如肌动蛋白就会成为干扰。因为肌动蛋白非常容易结合到抗体上然后对实验造成很大的干扰。通过加入10mM ATP到裂解缓冲液以及洗涤缓冲液中，肌动蛋白带来的问题就会解决了。,7.2.3免疫沉淀的结果分析,大多数情况下，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳也可以用做免疫沉淀。免疫沉淀复合物被溶解在SDS缓冲液中。该缓冲液中通常含有还原剂（巯基乙醇等），并且SDS用于减弱二硫键的作用。把样品加热以使蛋白完全变性。而沉淀基质可以通过不同的离心方法进行分离，含有抗原和抗体的上清液加到凝胶上即可。,根据显色方法的不同，抗体可能对实验没有什么影响，也可能带来很大麻烦。如果对样品进行了放射性特异标记，通过荧光自显影只能检测到样品中有信号的蛋白。在这种情况下，抗体不会造成什么影响；如果抗原的显色是通过蛋白染色剂来完成，而抗体的链与抗原或其某一个亚基具有相似的分子质量，那么抗体有可能会造成很大的干扰。如果抗体的量远远比抗原多，那么抗体的条带就有可能会完全覆盖抗原而影响到结果的分析。这时，抗体若能和基质有共价结合，这个问题就会被解决了。抗体不可能所有的肽链都和基质有共价交联，因此实验时SDS缓冲液中不能含有还原剂，否则抗体蛋白的轻链就会对实验结果造成干扰。,要增加抗原检测的敏感性，免疫沉淀技术和Western Blot相结合，对于有可能会带来麻烦的抗体，可以将其和沉淀基质共价交联起来。,