单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,精品课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,精品课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,精品课件,*,荧光,PCR,体系的优化及多色荧光,PCR,程扬健,厦门大学生命科学院分子诊断实验室,1,精品课件,荧光PCR体系的优化及多色荧光PCR程扬健厦门大学生命科学院,认识它们吗,？！,2,精品课件,认识它们吗？！2精品课件,什么是,Ct,值和,R,n,？,Ct,值中的,C,代表循环数（,Cycle,），,t,代表域值（,threshold,），,Ct,值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,Rn:,相对荧光强度,Ct,(S/B),3,精品课件,什么是Ct值和 Rn？Ct值中的C代表循环数（Cycle）,为什么用,Ct,值定量而不用终点相对荧光强度定量,4,精品课件,为什么用Ct值定量而不用终点相对荧光强度定量4精品课件,实时荧光,PCR,是如何定量？,利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表,Ct,值（如图所示）。因此，只要获得未知样品的,Ct,值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,在一定范围,:,Ct,值,1,lg C,5,精品课件,实时荧光PCR是如何定量？利用已知起始拷贝数的标准品可作出标,PCR,检测过程,样,品,处,理,PCR,扩,增,结,果,检,测,Real time PCR,6,精品课件,PCR检测过程样PCR结Real time PCR6精品课件,实时荧光定量,PCR,优化目标,1,、,Ct,值,2,、,Rn,值,3,、,R,值,7,精品课件,实时荧光定量PCR优化目标1、Ct值2、Rn值3、R值7精,优化内容,引物设计和筛选,探针设计和筛选,反应体系的优化,反应程序的优化,HCV,分子信标,8,精品课件,优化内容引物设计和筛选 HCV分子信标8精品课件,引物的设计与筛选,1,序列查找与比对,9,精品课件,引物的设计与筛选1序列查找与比对9精品课件,附：主要数据库的网址,数据库,组织,网址,MEDLINE,National Library of Medicine,www.nlm.nih.gov,GenBank,National Center for Biotechnology Information,www.ncbi.nlm.nih.gov,EMBL,European Bioinformatics Institute,www.ebi.ac.uk,DDBJ,National Institute of Genetics,Japan,www.ddbj.nig.ac.jp,SWISS-PROT,Swiss Institutes of Bioinformatics,www.expasy.ch,PIR,National Biomedical Research Foundation,www.nbrf.georgetown.edu,PRF,Protein Research Foundation,Japan,www.prf.or.jp,PDB,Research collaboratory for Structural bioinformatics,www.rcsb.org,CSD,Cambridge Crystallographic Data Center,www.ccdc.cam.ac.uk,10,精品课件,附：主要数据库的网址数据库组织网址MEDLINENation,二级结构分析,条件：,42,；,50mM Na,+,;2.5mM Mg,2+,http:/www.bioinfo.rpi.edu/zukerm/rna/,引物的设计与筛选,2,11,精品课件,二级结构分析条件：42；50mM Na+;2.5mM,HCV 5,UTR,引物,设计,5,3,HCV,引物的设计与筛选,3,12,精品课件,HCV 5 UTR引物设计53HCV引物的设计与筛,引物筛选结果,1,2,3,4,5,引物的设计与筛选,4,13,精品课件,引物筛选结果12345引物的设计与筛选413精品课件,引物用量的优化,不对称,PCR,（,S/A=1,：,4,）,Vs,对称,PCR,（,S/A=1,：,1,）,引物的设计与筛选,5,14,精品课件,引物用量的优化不对称PCR（S/A=1：4）Vs 对称PCR,探针设计和 筛选,1,探针设计,15,精品课件,探针设计和 筛选1探针设计15精品课件,探针设计和 筛选,2,探针的Tm值,16,精品课件,探针设计和 筛选2探针的Tm值16精品课件,探针设计和 筛选,3,退火温度的确定,17,精品课件,探针设计和 筛选3退火温度的确定17精品课件,探针用量的优化,0.6uM,0.3uM,0.15uM,探针设计和 筛选,4,18,精品课件,探针用量的优化0.6uM0.3uM0.15uM探针设计和 筛,不同,Taq,E,的比较,Taq 1,Taq 2,反应体系的优化,1,19,精品课件,不同Taq E的比较Taq 1Taq 2反应体系的优化119,Taq,E,浓度的优化,0.5 U/T,1.0 U/T,2.0 U/T,3.0 U/T,反应体系的优化,2,20,精品课件,Taq E浓度的优化0.5 U/T1.0 U/T2.0 U/,dNTP,浓度的优化,20uM/T,10uM/T,40uM/T,80uM/T,反应体系的优化,3,21,精品课件,dNTP浓度的优化20uM/T10uM/T40uM/T80u,Mg,2+,对荧光强度的影响,22,精品课件,Mg2+对荧光强度的影响22精品课件,Mg,2+,和退火温度的优化,-(方阵法）,23,精品课件,Mg2+和退火温度的优化,PCR,促进剂的影响,24,精品课件,PCR促进剂的影响 24精品课件,AMV,与,M-MLV,的比较,M-MLV,AMV,25,精品课件,AMV与M-MLV的比较M-MLVAMV25精品课件,M-MLV,的用量的优化,Well Ct,F127.373,F230.291,F526.144,F629.143,G126.205,G229.896,G526.221,G629.661,H226.279,H329.854,H40.000,10,u/test,20,u/test,30,u/test,40,u/test,50,u/test,NTC,F6,F5,26,精品课件,M-MLV的用量的优化Well Ct10u,高浓度,RNA,低浓度,RNA,比较了四个浓度：,24 U/T,12 U/T,8 U/T,4 U/T,RNA,酶抑制剂浓度的优化,27,精品课件,高浓度RNA低浓度RNA比较了四个浓度：RNA酶抑制剂浓度的,成 分,作 用,优化前浓度,优化后浓度,上游引物,DNA,正链扩增引物,0.15uM,0.15uM,下游引物,RNA,逆转录和,DNA,负链扩增引物,0.15uM,0.6uM,探针,与模板杂交，发送信号,0.15uM,0.6uM,Taq,酶,合成双链,DNA,1.2U/T,2U/T,dNTP,为模板复制提供原料,20uM/T,20uM/T,镁离子,支持,Taq,酶活性,1.5mmol,2.5mmol,逆转录酶,将,RNA,逆转录成,cDNA,30U/T,20U/T,RNA,酶抑制剂,防止,RNA,降解,12U/T,12U/T,扩增缓冲液,提供稳定的反应环境,pH8.6,pH8.6,优化前后含量对比,28,精品课件,成 分作 用优化前浓度优化后浓度上游引物DNA正链扩,逆转录时间的比较,逆转录时间（30,min；,45min,；60min）,45min,反应程序的优化,29,精品课件,逆转录时间的比较逆转录时间（30min；45min；60mi,RT-PCR,扩增程序优化,RT-PCR,扩增程序（优化前）,42,度，,60,分钟,95,度，,3,分钟,95,度，,30,秒,55,度,，,20,秒,逆转录,预变性,延伸,RT-PCR,扩增程序（优化后）,42,度，,45,分钟,95,度，,3,分钟,95,度，,10,秒,58,度,，,45,秒,逆转录,预变性,50,个循环,45,个循环,72,度,，,20,秒,退火,变性,退火 延伸,反应程序的优化,变性,30,精品课件,RT-PCR扩增程序优化RT-PCR扩增程序（优化前）42度,优化前后的比较,优化后,优化前,31,精品课件,优化前后的比较优化后优化前31精品课件,多色荧光PCR,双色荧光,PCR,三色荧光,PCR,多色荧光,PCR,32,精品课件,多色荧光PCR双色荧光PCR32精品课件,多色荧光,PCR,的特点,高效性，,在同一,PCR,反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体,.,系统性,，多重,PCR,很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检,.,经济性,，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息,.,33,精品课件,多色荧光PCR的特点33精品课件,双色荧光,PCR,不加内标（单色,PCR),加人内标,(,双色,PCR,）,FAM,JOE,34,精品课件,双色荧光PCR不加内标（单色PCR)加人内标 (双色PCR,三色荧光,PCR,FAM,HEX,Texas,Red,35,精品课件,三色荧光PCRFAMHEXTexasRed35精品课件,多色荧光,PCR,应注意的几个问题,HBV,HCV,HIV,3,、探针设计问题,HVB,2,、引物扩增问题,HCV,HIV,1,、反应原料问题,Taq,E,，,d NTP,，,逆转录酶等,36,精品课件,多色荧光PCR应注意的几个问题HBVHCVHIV3、探针设计,Thank you!,37,精品课件,Thank you!37精品课件,感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络，,如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！,感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络，,感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络，,如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！,感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络，,