,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,结核分枝杆菌（,TB,）分子生物学检测,结核分枝杆菌（TB）分子生物学检测,1,结核分枝杆菌,结核分枝杆菌,(M.tuberculosis),，,俗称结核杆菌，是引起结核病的,病原菌,。可侵犯全身各器官，但以,肺结核,为最多见。,结核病至今仍为重要的传染病。估计,世界人口,中,1/3,感染结核分枝杆菌。据,WHO,报道，每年约有,800,万新病例发生，至少有,300,万人死于该病。,我国建国前死亡率达,200-300,人,/10,万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因,艾滋病,、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。,结核分枝杆菌 结核分枝杆菌(M.tubercul,2,TB,形态,TB形态,3,全球感染情况,全球感染情况,4,实验诊断检测方法,常规检测方法,分子生物学检测方法,实验诊断检测方法常规检测方法,5,常规检测方法,一个月,二个月,三个月,常规检测方法一个月,6,分子生物学检测（,PCR,）方法,分子生物学检测（PCR）方法,7,回顾,RNA,与,DNA,回顾RNA与DNA,8,RNA,Vs,DNA,RNA-,核糖核酸,只存在於活细胞,非常脆弱，环境中存在水解酶（,RNase,）,单链结构,DNA-,脱氧核糖核酸,非常稳定，在死亡生物内也可存在,双链结构,RNA Vs DNARNA-核糖核酸,9,结核菌快速测定,Genprob Leader-50i,结核菌快速测定Genprob Leader-50i,10,方法,方法名称：,HPV,（,Hybridization Protection Assay,）,-,杂交保护分,析法为,Gen-probe,公司专利,检测设备：,LEADER 50i,方法方法名称：,11,不同方法结核菌检测报告时间,罗氏（,LJ,）培养,:2-8,周,HPA-MTD:2.5h,报告,直接从标本中检测结核菌,HPA-Accuprobe:1h,报告,用菌落或自动培养系统的菌液,不同方法结核菌检测报告时,12,HPA-MTD,方法检测,TB,HPA-MTD方法检测TB,13,优势（一）靶分子选取,核糖体,RNA-,RIBOSOMAL RNA,rRNA,作为靶分子好处：,生物扩增提高灵敏度,靶位独特的核酸次序保证检测特异性,靶分子,:rRNA,优势（一）靶分子选取核糖体RNA-RIBOSOMAL RN,14,优势（二）敏 感 度,10 000,套,r-RNA,C,A,T,A,T,A,T,G,C,G,C,A,T,T,A,A,T,C,G,T,A,G,C,G,C,G,C,A,T,A,T,G,C,T,A,C,G,T,A,DNA,RNA,聚合酶,(eg:E.coli),优势（二）敏 感 度 10 000 套CATATATGCG,15,样 本 前 处 理,样本,细胞溶解,目标,r-RNA,释放,样 本 前 处 理样本细胞溶解目标 r-RNA释放,16,杂 交,AE,60C,杂交体,rRNA,AE,AE,AE,AE,AE,AE,AE,探针,15,分钟,杂 交AE60C杂交体rRNAAEAEAEAEAEAEAE,17,选 择,60C,选择性试剂,AE,AE,AE,AE,AE,AE,AE,AE,选 择60C选择性试剂AEAEAEAEAEAEAEAE,18,ATA TRAINING/TP/Nov 97,19,PMT,Photo multiplicator,注射,1,注射,2,CPU,微机处理器,显示,打印机,键盘,化学发光读数仪,/,原理,结果测定,ATA TRAINING/TP/Nov 9719PM,19,MTD,结核分枝杆菌的直接检测意义,TB,与其他分枝杆菌区分,AIDS,患者鸟分枝杆菌小肠黏膜感染,龟分枝杆菌引起严重院内感染（南方某医院）,TB,耐药基因,发现并监测耐药菌株，为医生提供有效治疗,TB,复燃方案,提高,TB,检出率,CSF,、胸腹水等,疑似患者,长期低热、,ESR,持续增快，排除肿瘤和免疫性疾病患者，做血、,痰,TB,菌,PCR,MTD结核分枝杆菌的直接检测意义TB与其他分枝杆菌区分,20,Gen-Probe,结核分枝杆菌检测分析仪特点,采用分子技术快速鉴定,（,2.5,小时,）,结核分枝杆菌复合群；,标本可以是,涂片阴性或者阳性,的痰标本；也可以是培养物。,唯一获得,FDA,推荐,的凃阴样本快速检测技术,检测,RNA,，,RNA,只能来源于活的细菌，可鉴定活动性结核病人）,采用,TMA,恒温扩增,，不使用,PCR,仪器，无需专业的,PCR,实验室认证,HPA,杂交保护分析技术：灵敏、特异,严格的,实验室防污染技术,：整个实验过程所有试剂和样本全部在同一个反应管内进行，杜绝交叉污染。,Gen-Probe结核分枝杆菌检测分析仪特点采用分子技术快速,21,Geno,Type,MTBDR,plus,结核菌药敏试验,GenoType MTBDRplus,22,采用,线性探针技术,（,Line-Probe,或称,DNA-Strip,）,检测结核分枝杆菌复合群,利福平,(rpoB),和,异烟肼,(katG,和,inhA),等结核治疗药物的,耐药基因,来判断,TB,体内,耐药性,基本原理,采用线性探针技术（Line-Probe或称DNA-Strip,23,异烟肼：,katG,和,inhA,基因,katG,基因：,编码,触酶,-,过氧化物酶,40-100%,异烟肼耐药是由该基因突变引起且为高水平耐药,inhA,基因：编码,NADH,烯酰基,ACP,还原酶,25%,异烟肼耐药是由该基因突变引起且为低水平耐药,GenoType,MTBDRplus,检测举例,异烟肼：katG和inhA基因GenoType M,24,分枝杆菌复合群中的耐药基因,分枝杆菌复合群中的耐药基因,25,DNA,提取,PCR,扩增,探针杂交,结果判断,检测过程,DNA提取检测过程,26,DNA,提取,标本,固体或液体培养基培养的菌种,抗酸染色涂片阳性标本,方法,超声波裂解：,GenoLyse,试剂盒：,DNA提取标本,27,PCR,扩增,不同标本,扩增参数不同,培养菌种：扩增,20,个循环,涂阳标本：扩增,30,个循环,扩增产物：,扩增过程标记生物素,(Bio-11-dUTP,、,Bio-7-dATP,、,Bio-11-dCTP,?),PCR扩增,28,采用反向杂交方法,PCR,扩增产物变性（,DNA,成单链）与探针杂交洗涤显色判断结果,杂 交,采用反向杂交方法杂 交,29,杂交试剂,杂交试剂,30,TwinCubator,（可做,12,个条）,杂交仪（手工,12,条）,TwinCubator 杂交仪（手工,12条）,31,GT-Blot 20,杂交仪（自动,20,条）,GT-Blot 20 杂交仪（自动,20条）,32,GT-Blot 48,杂交仪（自动,48,条）,GT-Blot 48杂交仪（自动,48条）,33,野生型：有杂交带显色为“,+”,，表示未发生突变,耐药突变位点：有杂交带显色为“,+”,，表示发生突变,结果判断,结果判断,34,敏感：所有野生型探针“,+”,和所有耐药位点探针“,”,耐药：对应药物有,1,条野生型探针“,”,或有,1,条耐药位点“,+”,结果解释,敏感：所有野生型探针“+”和所有耐药位点探针“”结果解释,35,结果解释,结果解释,36,MTD,试验与其它试验方法性能比较,涂,阳（,+,）,患者的结果比较,检 测 敏感性 特异性 阳性预测值（,PPV,）阴性预测值（,NPV,）患者数,MTD 96.9%(31/32)100%(7/7)100%(31/31)87.5%(7/8)39,83.8%-99.9%59.0%-100%88.8%-100%47.3%-99.7%,BACTEC 96.9%(31/32)100%(7/7)100%(31/31)87.5%(7/8)39,83.8%-99.9%59.0%-100%88.8%-100%47.3%-99.7%,L J,87.5%(28/32)100%(7/7)100%(28/28)63.6%(7/11)39,71.0%-96.5%59.0%-100%87.7%-100%30.8%-89.1%,7H10/96.7%(29/30)100%(7/7)100%(29/29)87.5%(7/8)37,7H11 82.8%-99.9%59.0%-100%88.1%-100%47.3%-99.7%,MTD试验与其它试验方法性能比较涂阳（+）患者的结果比较,37,MTD,试验与其它试验方法性能比较,涂,阴（,）,患者的结果比较,检 测 敏感性 特异性 阳性预测值（,PPV,）阴性预测值（,NPV,）患者数,MTD,72%(18/25),99.3%(141/142),94.7%(18/19),95.3%(141/148),167,50.6%-87.9%,96.1%-100%,74.0%-99.9%,90.5%-98.1%,BACTEC 68.0%(17/25)100%(142/142)100%(17/17)94.7%(142/150)167,46.5%-85.1%97.4%-100%80.5%-100%89.8%-97.7%,L J,72.0%(18/25)100%(135/135)100%(18/18)95.1%(135/142)160,50.6%-87.9%97.3%-100%81.5%-100%90.1%-98.0%,7H10/60.0%(15/25)100%(142/142)100%(15/15)93.4%(142/152)167,7H11 38.7%-78.9%97.4%-100%78.2%-100%88.2%-96.8%,MTD试验与其它试验方法性能比较涂阴（）患者的结果比较,38,WHO,、盖茨基金会,推荐使用的快速线性探针技术，可以在,6,小时内给出药敏鉴定结果；,可以做,一线,结核药物（异烟肼 利福平）、,二线,结核药物的耐药检测（乙胺丁醇、氟喹诺酮类药物、可注射结核药物）；,标本是涂片阳性的,痰标本,，或者是,培养物,；,技术,步骤简单,：核酸提取、,PCR,扩增、核酸杂交仪检测；,核酸杂交仪有,三款,可选择：手工型（,12,个样本）、,GTBlot 20,（,20,个样本）和,GTBlot 48,（,48,个样本）；,每个试剂条上,自带质控,：,CC,杂交质控、,AC,扩增质控、,TUB,结核分枝杆菌质控，确保整个实验流程的可信度；,HAIN-,结核分枝杆菌耐药快速检测系统特点,WHO、盖茨基金会推荐使用的快速线性探针技术，可以在6小时内,39,Genprobe&Hain,产品市场段,结核病专科医院,(,胸科、结核病医院、结核病防治中心,),三级及以上综合性医院,监狱管理局医院,肿瘤专科医院,精神病医院,戒毒所,CDC,、,CIQ,、畜牧业,Genprobe&Hain产品市场段结核病专科医院(胸科、结,40,结核分子诊断技术,VIP,用户,北京医院,北京朝阳医院,西安西京医院,香港玛丽医院,四川华西医院,内蒙古自治区第四医院,新疆自治区传染病医院,国家,CDC,结核病预防控制中心,黑龙江省疾病预防控制中心,北京市结核病控制研究所,天津市疾病预防控制中心,上海市疾病预防控制中心,浙江省疾病预防控制中心,香港公共卫生检测中心,台湾卫生署疾病管制局,结核分子诊断技术VIP 用户北京医院,41,引进理由,临床需求,:,灵敏,+,准确,+,快速,政府决心,:,财力、物力、人力等方面的大力支持,引进理由临床需求:,42,政府的管理决心,一、,卫生部办公厅,组织