,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,白花蛇舌草饮片蛋白提 取与蛋白组分分析,答辩人：李华清,指导老师：方羽生,白花蛇舌草饮片蛋白提,1,研究目的,白花蛇舌草简介,白花蛇舌草饮片蛋白提取与蛋白组分分析,实验结果与讨论,实验注意事项,展望,研究目的,2,研究目的,1,、探索合适的蛋白提取方法；,2,、通过,SDS-PAGE,电泳获得白花蛇舌草饮片中主要的蛋白组分及分析其分子量；,3,、通过凝胶层析来纯化蛋白，并利用示差分析仪分析白花蛇舌草中糖肽的含量；,研究目的,3,白花蛇舌草简介,一、白花蛇舌草的形态特征,二、白花蛇舌草的临床应用,白花蛇舌草简介 一、白花蛇舌草的形态特,4,一、白花蛇舌草的形态特征,白花蛇舌草（,Hedyotis diffusa Willd,）,茜草科耳草属植物,，,一年生的带根全草,，,其叶狭长,，,形似蛇舌,，,又开白花,，,以形状之,，,故名白花蛇舌草。,一、白花蛇舌草的形态特征 白花蛇舌草（,5,二、白花蛇舌草的临床应用,1 治疗病毒性肝炎（HBV）,2 治疗癌症,3 治疗关节炎、炎症和疼痛,4 治疗痤疮、系统性红斑狼疮,二、白花蛇舌草的临床应用1 治疗病毒性肝炎（HBV）,6,白花蛇舌草饮片蛋白提取与蛋白组分分析,一、蛋白提取方法,二、电泳图像采集分析,三、层析后蛋白组分分析,白花蛇舌草饮片蛋白提取与蛋白组分分析 一、蛋白,7,一、蛋白提取方法,蛋白提取方法,丙酮沉淀法,硫酸铵沉淀法,提取液为：,40mmol,，,pH,为,4.45,或,7.0,的,Tris,溶液,提取液为：（,20mmol/L Tris-HCL,，,PH8.0,，含,5mmol/L,的,EDTA,、,10mmol/L,的,DTT 0.05mmol/L,的,SDS,）,一、蛋白提取方法蛋白提取方法丙酮沉淀法硫酸铵沉淀法提取液为：,8,试剂,15%,分离胶,/mL,6%,浓缩胶,/mL,双蒸水,0.5,2.62,30%,丙烯酰胺,2.5,0.8,1.0mmol/L Tris,（,pH8.0,）,1.9,0.5,10%SDS,0.05,0.04,10%AP,0.05,0.04,TEMED,0.002,0.004,总体积,5,4,胶的配制,试剂 15%分离胶/mL 6%浓缩胶/mL 双蒸,9,二、电泳图像采集分析,图,1,丙酮沉淀法提取蛋白的电泳图,二、电泳图像采集分析 图1 丙酮沉淀法提取蛋白的电泳图,10,图,2,硫酸铵沉淀法提取的蛋白电泳图,图2 硫酸铵沉淀法提取的蛋白电泳图,11,三、层析后蛋白组分的分析,本实验主要是用,G-75,的方法来纯化蛋白，还通过示差仪来检测白花蛇舌草中的糖肽含量。,三、层析后蛋白组分的分析本实验主要是用G-75的方法来纯,12,层析后蛋白电泳图谱,图,4,层析后蛋白电泳图,层析后蛋白电泳图谱 图4 层,13,实验结果与讨论,一、实验结果,二、实验结论,实验结果与讨论,14,一、实验结果,1,、不同蛋白提取方法比较,蛋白提取方法,蛋白电泳条带数,蛋白带清晰度,条带偏移度,技术繁琐度,丙酮沉淀法,多（六条）,清晰,垂直,简单,硫酸铵沉淀法,多（六条）,清晰,垂直,复杂,一、实验结果1、不同蛋白提取方法比较蛋白提取方法蛋白电泳条带,15,2,、由图,3,可以知道，白花蛇舌草饮片主要含有四个组分的蛋白，两个糖肽峰，在相应的一号峰、二号峰和三号峰之间含有少量的糖肽。,2、由图3可以知道，白花蛇舌草饮片主要含有四个组分的蛋白，两,16,二、实验结论,1,、根据图,1,、图,2,的电泳图可知，,白花蛇舌草饮片主要有六条蛋白条带，其分子量约在,12533,100116Da,之间，而且该范围的蛋白均比较清晰，说明了白花蛇舌草饮片蛋白在该分子量范围内的蛋白含量相对较高，即是白花蛇舌草饮片中含有大量的中分子量蛋白，小分子与大分子物质较少。,二、实验结论1、根据图1、图2的电泳图可知，白花蛇舌草饮片,17,2,、从电泳后的图,4,看出，色带条数区别不太明显，分子量在,19261-131266,之间，而且,Sephadex G-75,凝胶柱分离蛋白质的范围是,3000-80000,，所以样品中的小分子蛋白和大分子蛋白都不能很好地分离，因此分离效果不好。,2、从电泳后的图4看出，色带条数区别不太明显，分子量在192,18,3,、本实验主要是通过冻干的方法来浓缩层析后的蛋白，但是因为,G-75,的缓冲液中含有,0.15mol/L,的,NaCl,，所以冻干的粉末中含有大量的盐。因此，要通过超滤来除盐，也可以达到提高浓度的目的。但是冻干容易损失蛋白，超滤也容易损失小分子蛋白。,3、本实验主要是通过冻干的方法来浓缩层析后的蛋白，但是因为G,19,实验中的注意事项,（3）根据装柱要求一次性将凝胶均匀置入空柱内，注意保证湿态装柱，并避免柱内产生气泡和断层。,（4）把柱子连到层析仪时，先运行层析仪，使连接管有液体流出，再把柱子连接到仪器上，目的是排出管子中的气泡。,（5）示差仪在使用前要先排除气泡，先排样品池，然后按balance同时排样品池和参比池。,（6）温度越高，G-75就越容易长菌。因此，上完样后，要先用双蒸水冲洗柱子，再用20%的乙醇冲洗和浸泡柱子。,（,1,）胶的凝固速度与气温有关，温度越低，胶越难凝固。因此，冬天制胶需要放在烘箱中凝固，但会造成胶的一部分凝得快，另外一部分凝得比较慢，那么，跑出来的条带就会越跑越宽，或者前一天晚上配好胶，留待第二天用。,（,2,）电极缓冲液不能加太少，否则没有电流；但是加太满会造成电流过大，使电极缓冲液变成黄色，使用的次数会减少。,实验中的注意事项（3）根据装柱要求一次性将凝胶均匀置入空,20,展望,一是加强药理方面的研究；,二是在本实验的基础上，进一步分离及研究其有效成分，为以后开发新药打下基础。,展望一是加强药理方面的研究；,21,谢谢,谢谢,22,