单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞组分的分级分离,实验九,通过细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞的组分，了解其原理、过程及作用。,实验目的,细胞内不同结构的比重和大小都不同。在同一离心场内的沉降速度也不相同。根据这一原理，用不同的转速的离心法，可将细胞内各种组分分级分离出来。,实验原理,速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀,实验内容,细胞核的分离提取,高速离心分离提取线粒体,细胞核的分离提取步骤：,1.,椎脱臼法法处死小鼠，迅速开腹取肝脏，剪成小块，置于盛有,0.9,NaCl,烧杯中，反复洗涤，除去血污，用滤纸吸去表面的溶液。,2.,将湿重约,1g,的肝组织放在小平皿中，取,8ml,预冷的,0.25mol/L,蔗糖,-0.003mol/L,氯化钙溶液，先加入少量该溶液于平皿中，尽量剪碎组织后，再全部加入。,3.,将剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，研磨,3,5,次，用,8,层湿纱布过滤匀浆于离心管中。然后制备一张涂片，做好标记，自然干燥。,4.,将装有滤液的离心管配平后，放入离心机，,2500r/min,离心,15,分钟；取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用,;,同时涂一张上清液片做好标记，自然干燥；余下的沉淀物进行以下步骤。,5.,用,6ml 0.25mol/L,蔗糖,-0.003mol/L,氯化钙溶液，悬浮沉淀物，以,2500r/min,离心,15,分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片，自然干燥。,6.,将、涂片用,1,甲苯胺兰染色后盖上盖片即可观察。,高速离心分离提取线粒体步骤：,1.,将上述装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以,17000r/min,离心,20,分钟，弃上清，留取沉淀物。,2.,加入,0.25mol/L,蔗糖,-0.003mol/L,氯化钙液,1ml,，用吸管吹打成悬液，以,17000r/min,离心,20,分钟。将上清吸入另一试管。留取沉淀物，加入,0.1ml 0.25mol/L,蔗糖,-0.003mol/L,氯化钙溶液混匀成悬液。,3.,取沉淀物上清液和悬液，分别滴一滴于干净的载玻片上（分别标记为、），涂片，各滴一滴,0.02,詹纳斯绿,B,染液，盖上盖片染,20,分钟。,4.,油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿,B,染成兰绿色。,1,研磨时要在低温进行。,2,过滤前要先将纱布湿润。,3,离心前要注意配平。,注意事项,1.,简要说明分级分离细胞的原理及其意义。,2.,比较一下分离细胞核时涂片、有什么不同？涂片在你的实验结果中纯度如何？,3.,描述一下涂片所见结果。,作业与思考,谢,谢,大,家,