单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,RHO/ROCK,通路在创伤性脑损伤后神经再生中的作用机制,研究方向：神经损伤与修复 专业：神经外科,研究类别：基础研究 项目来源：国家自然科学基金项目,导师：段虎斌 学生：崔刚,RHO/ROCK通路在创伤性脑损伤后神经再生中的作用机制,1,主要内容,立论依据,研究目标、内容、方法,拟解决关键问题、可行性分析,创新,点,研究进度、预期成果,经费预算,、,参考文献,主要内容立论依据,2,立论依据,创伤性脑损伤（,TBI,）致死、致残率很高，给社会家庭造成巨大损失。在美国每年约有1，700，000人遭受TBI，其中约52，000人死亡，直接和间接经济损失达600亿美元。我国每年约有10万人,死,于,TBI,，其中，因车祸死亡约5万人，这一数字也呈上升趋势,。,立论依据创伤性脑损伤（TBI）致死、致残率很高，给社会家庭造,3,立论依据,本课题为,国家自然基金项目-“创伤性脑损伤的神经源性机制及其干预实验研究”,的,后续研究，着重讨论,Rho/Rock,通路在,TBI,后神经源性炎症和神经再生修复中的作用机制,探索新的干预措施，从新角度探求脑创伤后神经修复的新治疗策略和方案。,立论依据本课题为国家自然基金项目-“创伤性脑损伤的神经源性机,4,立论依据,本研究采用,TBI,大鼠模型，以脑组织内,NF-B,等为,神经源性炎症反应,的指标，,脑细胞线粒体、神经突触等超微结构变化,为,神经病理损伤,指标，,Nogo-A,等为,阻碍神经再生,的指标，,BDNF,等为,促进神经再生,的指标，探究该通路在调控神经再生中的作用机制,立论依据本研究采用TBI大鼠模型，以脑组织内NF-B等为神,5,立论依据,机制假设：,TBI,激发神经源性炎症，激活,Rho/Rock,通路，致球蛋白轻链磷酸化酶（,MLCP,）活性受抑制，引起脑血管平滑肌收缩，血流下降，内皮及屏障功能受损，导致脑组织缺血，阻碍神经再生，脑血管周围炎性物质渗出增加，引发血管性、细胞性脑水肿和脑细胞调亡。使用,Rho,激酶、,NF-B,抑制剂和神经营养因子等干预措施，松弛血管平滑肌，扩张血管，促进脑组织血供，改善神经再生微环境,这为,TBI,的早期干预和康复治疗提供了新思路。,立论依据机制假设：TBI激发神经源性炎症，激活Rho/Roc,6,图,1 Rho/Rock,经典信号通路,Rho/Rock,信号通路的成分主要有,三个,：小,G,蛋白,(,在这里主要是指,Rho),、与,Rho,相连的,Rho,激酶,(Rho-kinase),和,Rho-kinase,的效应分子,3-5,。,图1 Rho/Rock经典信号通路Rho/Rock信号通路的,7,研究目标,（,1,）探讨,Rho/ROCK,信号通路在,TBI,后神经源性炎症中的作用机制；,（,2,）研究,Rho/ROCK,信号通路在控,TBI,后中枢神经系统修复微环境的作用及其机制；,（,3,）观察多种干预措施对,Rho/ROCK,信号通路的影响及其在治疗,TBI,中的应用价值。,研究目标（1）探讨Rho/ROCK信号通路在TBI后神经源性,8,（1）通过免疫组化和电镜观测Rho、ROCK、NF-B、BDNF、NOGO-A等在对照组（假手术组）及实验组（颅脑损伤动物模型组）SD大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及周边区脑组织中的分布特征和定位规律，以寻找组织学根据；,（2）通过分子生物学手段（如PCR）测定对照组及实验组大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及其周边脑细胞中Rho、ROCK、NF-B、BDNF、NOGO-A等的基因表达水平。,（3）取大鼠大脑中动脉（MCA）做Rho激酶活性、MLCP活性、MLCK活性及MLC磷酸化水平测定。,（4）观察干预措施（Rho激酶抑制剂）对上述（,1,）,（3）变化的影响,；,（5）上述几项中改变和变化的相关性分析。,研究内容,（1）通过免疫组化和电镜观测Rho、ROCK、NF-B、B,9,（,1）未干预TBI组：,实验采用SD大白鼠（山西医科大学实验动物中心提供），体重270-290g，乌拉坦腹腔注射（1.2mgkg-1）麻醉满意后，将大鼠固定在脑立体定位仪上（ST-T型，日本成贸公司）。制作TBI模型时沿正中线切开头皮并剥离骨膜,切口长2cm，暴露右顶骨，牙科台式电钻(宁波医疗器械厂)于冠状缝后1.5mm,中线右旁2.5mm处钻一直径为5mm的圆形骨窗,保持硬脑膜完整，将撞杆头端置骨窗处,击锤（重20g）沿外周导管分别从10cm、30cm高处自由落下冲击撞杆,造成右顶叶轻、中度脑挫伤,另用击锤（重40g）沿外周导管从25cm高处自由落下冲击撞杆,造成右顶叶重度脑挫伤,致伤冲击力分别为0.028Ns、0.048 Ns和0.088 Ns，硬膜保持完整，骨蜡封闭骨窗。TBI组按损伤程度分为轻、中、重三组。于伤后0.5、6、12、24、48、72h断头取血，开颅取脑，进行如下实验：,实验方法,（1）未干预TBI组：实验方法,10,rhorock通路在创伤性脑损伤后神经再生中的作用机制ppt课件,11,免疫组化和电镜观测Rho、ROCK、NF-B、神经营养因子、NOGO-A等在对照组（假手术组）及实验组（颅脑损伤动物模型组）SD大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及周边区脑组织中的分布特征和定位规律，以寻找组织学根据；,通过分子生物学手段（PCR）测定对照组及实验组大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及其周边脑细胞中Rho、ROCK、NF-B、神经营养因子、NOGO-A、等的基因表达水平；,取大鼠大脑中动脉（,MCA）做Rho激酶活性、MLCP活性、MLCK活性及MLC磷酸化水平测定。,实验方法,免疫组化和电镜观测Rho、ROCK、NF-B、神经营养因,12,（2）干预TBI组：,撞击鼠脑后使用Rho激酶抑制剂（Hydrochloride Fasudil,、,Y-30141,）,、,NF-KB,抑制剂,-PDTC,、神经营养因子等,对TBI组上述3项改变的影响。,各种干预措施,（,如 Rho激酶抑制剂,-,Y-30141,、,NF-KB,抑制剂,）,对神经损伤修复的影响,（,3,）统计学分析 上述各项中改变和变化的相关性分析。,实验方法,（2）干预TBI组：实验方法,13,技术路线图,技术路线图,14,拟解决的关键问题,（,1,）,大,鼠大脑中动脉的分离，需要显微镜下仔细操作，技术要求高，我科实验室有实验用手术显微镜并有老师指导，仍需要不断练习，提高显微操作技能。,（,2,）各种干预措施,（,如 Rho激酶抑制剂,-,Y-30141,、,NF-KB,抑制剂,）,对神经损伤修复的影响，国内外前期研究少，需要不断摸索实验条件。,4-,氨基吡啶类（,Y-30141,）,异喹啉类（,H-1152P,）,拟解决的关键问题4-氨基吡啶类（Y-30141）异喹啉类（,15,（1）项目的设计构思是建立在以往工作基础上，是国家自然基金的后续深入研究，现已建立了稳定的实验动物模型和实验方法，并且已开展有关方面的研究，得到初步结果；,（,有前期研究基础）,（2）本项目采用成熟的动物模型，成熟的分子生物学、放射免疫学、病理学技术,；（,在方法学方面是可行的,）,（3）本人的指导老师和项目组成员有长期科研实践经验，为本课题提供技术和理论指导；,（4）项目申请人所在学科有专用实验室，所在实验室和所在单位拥有课题,相关的实验设备，,导师课题经费充足，实验动物及相关试剂均可购买到,。（,实验条件具备，可以确保实验如期完成）,可行性分析,可行性分析,16,（,1,）关于,Rho/ROCK,信号转导通路在,TBI,后神经源性炎症中的作用机制目前尚未见相关文献报道。,（,2,）关于,Rho/ROCK,信号转导通路在调控,TBI,后神经再生和功能修复微环境中的作用机制，目前尚未见相关文献报道。,（,3,）关于多种干预方法（,Rho,激酶抑制剂、,NF-KB,抑制剂、,NPY-,受体阻抑、,NK1-,受体阻抑、干细胞细胞移植等）在颅脑损伤期对,Rho/ROCK,信号转导通路的影响机制，尚未见相关文献报道。,创新点,（1）关于Rho/ROCK信号转导通路在TBI后神经源性炎症,17,（1）2019年01月份2019年4月份：完成假手术组的免疫组化、电镜 和分子生物学实验。,（2）2019年,5,月份,2019年,8,月份：完成颅脑损伤未干预组,的免疫组化、电镜 和分子生物学实验。,（3）2019 年,9,月份,2019年12月份：完成颅脑损伤干预组的免疫组化、电镜 和分子生物学实验。,（,4,）201,6,年,1,月份,2019年,3,月份,：建立实验数据库，统计分析实验数据，总结课题，撰写论文，发表有关论文，准备论文交流与答辩。,研究进度,（1）2019年01月份2019年4月份：完成假手术组的免,18,（,1,）,Rho/ROCK,信号转导通路在,TBI,后神经源性炎症中发挥重要作用，脑血管,Rho,激酶含量与脑组织,NF-B,表达水平之间存在相关性；,（,2,）,Rho/ROCK,信号转导通路在调控,TBI,后神经再生和功能修复微环境中发挥枢纽作用，脑血管,Rho,激酶与促进和抑制神经再生的因子（如神经营养因子和,NOGO-A,）之间存在相关性；,（,3,）,Rho,激酶抑制剂通过干预,Rho/ROCK,信号转导通路，对减轻,TBI,的严重程度、促进神经再生和功能恢复方面能起一定作用，为临床治疗,TBI,提供新思路和新方法。,（,4,）成果以论文形式发表,预期成果,（1）Rho/ROCK信号转导通路在TBI后神经源性炎症中发,19,经费预算,金额（万元）,计算根据及理由,支出预算合计,5,一、设备费,0.3,1,购置费,0.0,2,试制费,0.3,预实验实验试剂及实验动物费用,二、能源材料费,3.5,实验动物及试剂费用,三、资料及印刷费,1.2,发表论文、检索、装订论文、复印资料等费用,六、其他费用,0.0,参考文献：,经费预算金额（万元）计算根据及理由支出预算合计5一、设备费0,20,参考文献：,1.Traumatic Brain Injury in the United States:Emergency Department Visits,Hospitalizations,and Deaths,2019-2019.cdc.gov/TraumaticBrainInjury/index.html,2.,王忠诚,.,神经外科学,.,湖北：湖北科学技术出版社，,2019.365,3.Fujimura M,Usuki F,Kawamura M.Inhibition of the Rho/ROCK pathway prevents neuronal degeneration in vitro and in vivo following methylmercury exposure.Toxicol Appl Pharmacol.2019,250(1):1-9.,4.Cheng R,Shao MY,Yang H.The effect of lysophosphatidic acid and Rho-associated kinase patterning on adhesion of dental pulp cells.Int Endod J.2019,44(1):2-8.,5.Haydont V,Bourgier C,Vozenin-Brotons MC.Rho/ROCK pathway as a molecular target for modulation of intestinal radiation-induced toxicity.Br J Radiol.2019,80(1):S32-4