,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,AFP,基因表达检测,RT-PCR,(Reverse transcription PCR),甲胎蛋白,DNA,序列,mRNA,反转录生成的,cDNA,可作为,PCR,的模板进行扩增称为,RT-PCR,，,RT-PCR,比,Northern,杂交更灵敏，对,RNA,的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。,实验原理,被,污染的试剂，缓冲液,移液器,使用的器皿及,tip,等,操作者的手，头发等,RNA,操作中应注意的问题：,防止,RNase,污染,外源,RNase,的主要来源：,RNA,的提取,当处理,RNA,时，移液器专用,保证,RNA,实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液等留出专用；,溶液和试剂分装成小份保存；,RNA,电泳装置专用（清洗、处理、,DEPC,处理过的水冲洗）；,防止外源,RNase,污染的主要措施,准备所有的溶液和缓冲液时，使用无,RNA,酶的玻璃器皿，,DEPC,处理过的水，用于,RNA,的化学药品使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话，用,0.1,的,DEPC,在,37,C,处理溶液,1,小时后在,15psi(1.05kg/cm,2,高压蒸气灭菌,15min,。,180,300,C,烘烤玻璃器皿,4hrs,以上或用其它灭活,RNA,酶的商品化产品处理塑料制品；,使用新的、无,RNA,酶的一次性,tubes,tips,等；,在分离,RNA,的过程中用,RNA,酶抑制剂以抑制,RNA,酶的活性。,防止外源,RNase,污染的主要措施：,材料要新鲜,;,裂解过程要同,RNase,活性抑制同步,防止内源,RNA,酶降解,RNA,DEPC:,是,高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧基甲酸化形式破坏,RNase,的活性,氧钒核糖核苷复合物,:,能与多种,RNA,酶活性位点结合并几乎百分之百地抑制,RNA,酶的活性,RNA,提取,RNA,的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和,cDNA,的合成都是必须的，,RNA,的纯度和完整性对于,Northern blot,RT-PCR,和,cDNA,文库的构建等分子生物学实验都至关重要。,RNA,分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少,RNA,酶的污染。,实验目的：,学习,RNA,的简易制备过程，通过,RNA,电泳带评价,RNA,质量,实验材料：,水,HCC,患者的外周血单核细胞（,PMNCs,）,AFP mRNA,1.,外周血单个核细胞,(P MNCs),的分离 取受检者外周血,5 ml,肝素抗凝。采用密度梯度离心法,用淋巴细胞分离液分离收集,P MN Cs,。,2.,P M NCs,的总,R NA,的提取,用,Tr iz ol R N A,提取液,(GI BCO BRL),以改良的异硫,氰酸胍,-,酚,-,氛仿一步法提取总,R AN,放,-80,保存。,并抽提,Hep G2,细胞株的总,R N A,放,-80,保存,提取方法：,RNA,降解的主要原因,取样后没有立即抽提,RNA,；,抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围；,样品运输、保藏不当，或,RNA,保藏不当，应放入,-70,，而不是,-20,）,使用的溶液或器皿有,RNase,污染,琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时,pH,值低于,3.5,RNA,污染的原因,样品太多，所加试剂相对太少,用来分离,RNA,的样品中含有机溶剂（乙醇，,DMSO,等），或碱溶液等,RT-PCR,(Reverse transcription PCR),实验目的：,学习,RT-PCR,的原理及其操作过程,实验材料：,PMNCs,的,mRNA,PCR,技术,PCR,（多聚酶链式反应,是一种体外扩增特异,DNA,片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板,DNA,、引物和,dNTPs,的存在下依赖于,DNA,聚合酶的酶促反应。,PCR,技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为,变性,（,denaturation,，）,退火,（,annealing,）、,延伸,（,extension,）三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异,DNA,片段得到大量扩增。,模板,DNA,：一般,10,2,10,5,个拷贝,Mg,2,：,Mg,2,能影响反应的特异性和扩增片段的产率。一般反应体系中,1.5-2.5 mmol/L,反应反冲液：使,Taq DNA,聚合酶的作用环境维持偏碱性。,dNTP,：在,PCR,反应体系中其浓度一般为,20,200,mol/L,，浓度过高、过低都不利。,Taq DNA,聚合酶：在,70,75,C,具最高活性。具有,5,3,的聚合酶活性和,5,3,的外切酶活性，无校正功能。是镁依赖性酶。,引物：,PCR,反应中引物浓度一般为,0.1,0.5,mol/L,。,PCR,反应体系中的主要成分及其作用：,RT-,PCR,R T-PCR,所用引物由中科院上海生物工程公司合成,引物序 列 如 下,:AF P,上 游 引 物,:5 -T G CA GCCA AA GT GA AG A GG G-3 ;AF P,下 游 引 物,:5 -C AA GCT GCT TT CT CTT A AT T C-3,-,a c tin,上 游 引 物,:5 -T CT A C AAT GA GCT GC GT GT G G-3,-,a c ti n,下 游 引 物,5 G GA ACC GCT CAT T GCC AA T G-3,。,-,a c tin,作为内参照。,同时以,Hep G2,总,P N A,作为阳性对照、水作为阴性,对照进行扩增,排除假阳性和假阴性的情况。,取,1,g,总,R NA,加入随机引物,0.5,g,70,温浴,5,分钟,迅速放置冰浴中,再加入,2.5 m M d NTP 4,l,R N A,酶抑 制 剂,25u,5 xR T,缓 冲 液,5,l,M M L V,逆 转 录 酶,(Pr o me ga)200u,加,D EP C,处理 水至总体积,25,l,。,37,温浴,1,小时,迅速放于冰中,-80,冰箱保存。,反转录,再加入,10 x PCR,缓冲液,5,l,25 m M Mg Cl2,溶液,3,l,Ta qD N A,聚合酶,2u,加去离子水至总体积,5 0,l,。,94,变性,30,秒,59.5,退火,30,秒,72,延伸,40,秒,共进行,30,个循环,末次循环后,72,延伸,7,分钟。,PCR,反应循环条件设置：,根据引物及基因的表达水平设置循环参数：如引物序列、引物长度、扩增片段的长度及,mRNA,的丰度等,退火及延伸,同时以,Hep G2,总,RN A,作为阳性对照、水作为阴性对照进行扩增,排除假阳性和假阴性的情况。,阳性对照组：用倍比稀释法将不同数 量的,Hep G2,细胞加入到,10 ml,正常人外周血中,(,白细胞,10,7,/ml),再提取,P MN Cs,的总,R N A,并行,RT-PCR,对照实验,Taq,酶过多；,Mg,2+,浓度不合适；,引物浓度过高或设计不合理；,复性温度过低；,循环次数过多；,模板量过多；,PCR,产物的电泳检测时出现拖带或非特异性扩增带的可能原因：,PCR,扩增产物电泳检测,点样或染胶问题,反应体系中忘记加入某种成分,(,无扩增产物）或分装,mixture,时出了问题；,目的片段太大，使用的,DNA Polymerase,无法扩增出目的片段；,DNA,溶液中或反应体系中含有,Taq,酶抑制剂，抑制了,Taq DNA,聚合酶的活性。,退火温度太高；,Taq,酶活力不够或其他试剂有问题；,引物设计不合理，与模板不配对等。,导致,PCR,产物很少或无扩增产物的原因,凝胶电泳检测,PCR,产物时，目的扩增带很弱或看不到目的扩增带，应从以下几个方面寻找原因：,