Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,ITI Confidential,SNP,及突变研究的最新工具高分辨率熔解曲线（,High Resolution Melting,）突变筛查和基因分型系统,北京思博全科技有限公司,SNP及突变研究的最新工具高分辨率熔解曲线（High,高分辨率溶解曲线HRMppt课件,2,内容提示,高分辨熔解曲线（,High Resolution Melting,）,高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用,筛查突变,（,mutation scanning,）,基因分型,（,Mutation Genotyping,）,小片段,+,内标法（,Small Amplicon Genotyping,）,非标记探针法（,Unlabeled Probe Genotyping,，,LunaProbe,）,SSR,分析,检测甲基化,HRM,仪器,内容提示高分辨熔解曲线（High Resolution Me,3,高分辨率溶解曲线HRMppt课件,4,High Resolution DNA Melting,（,HRM),是基于有序列变化的,Amplicon,之间微弱的,Tm,值差异，通过,DNA,片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：,High Resolution DNA Melting（HR,5,PCR,Tube 1,Tube 2,Tube 3,Wild type,Homozygote,Heterozygote,LightScanner,突变检测原理,PCRTube 1Tube 2Tube 3Wild type,6,Lightscanner,高分辨溶解曲线结果,Lightscanner高分辨溶解曲线结果,7,Saturating dye,LC Green plus,高分辨溶解曲线专用荧光染料,Saturating dyeLC Green plus,内容提示,高分辨熔解曲线（,High Resolution Melting,）的定义,高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用,筛查突变,（,mutation scanning,）,基因分型,（,Mutation Genotyping,）,小片段,+,内标法（,Small Amplicon Genotyping,）,非标记探针法（,Unlabeled Probe Genotyping,，,LunaProbe,）,SSR,分析,检测甲基化,HRM,仪器,内容提示高分辨熔解曲线（High Resolution Me,9,Mutation Scanning,未知,SNP,扫描,Mutation Scanning未知SNP扫描,M.H.Ye,等对北京油鸡,CAPN1,基因外显子进行扫描，筛查其潜在,SNPs,。,M.H.Ye等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描，筛查其,11,Bernhard J.HoWnger Hai-Chun Jing Kim E.Hammond-Kosack Kostya Kanyuka,(Barley Application),Theor Appl Genet(2009)119:851865,DOI 10.1007/s00122-009-1094-2,数据来自英国洛桑农业实验站,Bernhard,等对,Barley,的,eukaryotic translation,initiation factor 4E(eIF4E)gene,基因外显子进行突变扫描结果,Bernhard J.HoWnger Hai-Chun,高分辨率溶解曲线HRMppt课件,内容提示,高分辨熔解曲线（,High Resolution Melting,）的定义,高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用,筛查突变,（,mutation scanning,）,基因分型,（,Mutation Genotyping,）,小片段,+,内标法（,Small Amplicon Genotyping,）,非标记探针法（,Unlabeled Probe Genotyping,，,LunaProbe,）,SSR,分析,检测甲基化,HRM,仪器,内容提示高分辨熔解曲线（High Resolution Me,14,Small Amplicon Genotyping,扩增小片段直接进行基因型鉴定,Small Amplicon Genotyping,使用已知,Tm,值的双链,DNA,做温度内标，低温内标,Tm(61,),高温内标,Tm(,92),内标能够实现,96/384,孔板的温度均一矫正。,PCR,片段的,Tm,值范围：,70-88,优点：不需要探针，直接利用,PCR,产物针对已知突变位点进行基因分型,使用已知Tm值的双链DNA做温度内标，低温内标Tm(61,16,高分辨率溶解曲线HRMppt课件,17,高分辨率溶解曲线HRMppt课件,18,高分辨率溶解曲线HRMppt课件,19,为何要使用温度内标,为何要使用温度内标,AT SNP,without,Calibration 72bp,AT SNP without Calibration,Apply Temperature Calibration,Apply Temperature Calibration,AT SNP,with,Calibration,AT SNP with Calibration,Small Amplicon Genotyping,M.H.Ye,等对北京油鸡,A-FABP,基因进行小片段法基因分型，扩增片段为,56bp,，灰色曲线显示的是杂合型（,CT,），蓝颜色和红颜色曲线分别代表纯合型,CC,和,TT,。,Small Amplicon GenotypingM.H.Y,24,内容提示,高分辨熔解曲线（,High Resolution Melting,）的定义,高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用,筛查突变,（,mutation scanning,）,基因分型,（,Mutation Genotyping,）,小片段,+,内标法（,Small Amplicon Genotyping,）,非标记探针法（,Unlabeled Probe Genotyping,，,LunaProbe,）,SSR,分析,检测甲基化,HRM,仪器,内容提示高分辨熔解曲线（High Resolution Me,25,HRM Lunaprobe genotyping,HRM Lunaprobe genotyping,HRM Lunaprobe genotyping,HRM Lunaprobe genotyping,1 Probe 1 SNP,All Possible SNPs,1 Probe 1 SNP,All Possible,1 Probe 1 SNP,All Possible SNPs,Class 1 C:T,G:A,Class 2 C:A,G:T,Class 3 C:G,Class 4 A:T,1 Probe 1 SNP,All Possible,1 Probe,2 SNPs,1 Amplicon,1 Probe,2 SNPs,1 Amplicon,2 Probes,2 SNPs,1 Amplicon-ApoE,2 Probes,2 SNPs,1 Amplicon-,2 Probes,2 SNPs,2 Amplicons-HFE,2 Probes,2 SNPs,2 Amplicons,Amplicon Scanning,发现新的突变,Amplicon Scanning 发现新的突变,David De,，,Yong Song at el.Application og high,-resolution DNA melting for genotyping and variant scanning of diploid and autotetraploid potato Mol Breeding(2010),25:6790,rr,RR,Rr,Mix Rr:rr by 1:1 Rrrr,Mix RR:Rr by 1:1 RRRr,David De，Yong Song at el.Ap,内容提示,高分辨熔解曲线（,High Resolution Melting,）的定义,高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用,筛查突变,（,mutation scanning,）,基因分型,（,Mutation Genotyping,）,小片段,+,内标法（,Small Amplicon Genotyping,）,非标记探针法（,Unlabeled Probe Genotyping,，,LunaProbe,）,SSR,分析,检测甲基化,HRM,仪器,内容提示高分辨熔解曲线（High Resolution Me,35,Rosario Muleo,（,2009,）等用,HRM,方法对三个品种的,SSR DCA4,进行分析，,DCA4,的等位基因有,131bp,的重复序列，杂合等位基因的序列为,131-133bp,，分析结果如图,8,所示，,HRM,曲线可以将纯合样品和杂合样品明显的区分，其中一个等位基因只相差,2bp,。,三种颜色（浅灰，深灰、黑色）表明,3,种不同的品种。,Rosario Muleo,等得出结论：,HRM,是一种快速、重复性高、成本低，操作简单，且可以应用于其他物种的,SNP,检测及,SSR,基因分型的方法。,Rosario Muleo,Marir Chiara Colao,Dario Miano at el.2009 Genome52:252-260,Rosario Muleo（2009）等用HRM方法对三个品,内容提示,高分辨熔解曲线（,High Resolution Melting,）的定义,高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用,筛查突变,（,mutation scanning,）,基因分型,（,Mutation Genotyping,）,小片段,+,内标法（,Small Amplicon Genotyping,）,非标记探针法（,Unlabeled Probe Genotyping,，,LunaProbe,）,SSR,分析,检测甲基化,HRM,仪器,内容提示高分辨熔解曲线（High Resolution Me,37,高分辨率溶解曲线HRMppt课件,高分辨率溶解曲线HRMppt课件,高分辨率溶解曲线HRMppt课件,内容提示,高分辨熔解曲线（,High Resolution Melting,）的定义,高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用,筛查突变,（,mutation scanning,）,基因分型,（,Mutation Genotyping,）,小片段,+,内标法（,Small Amplicon Genotyping,）,非标记探针法（,Unlabeled Probe Genotyping,，,LunaProbe,）,SSR,分析,检测甲基化,HRM,仪器,内容提示高分辨熔解曲线（High Resolution Me,41,2005,LightScanner 96/384,96/384,孔板,8,分钟,/,板,2-6,秒,/,样品,温度均一性：,0.15,o,C,数据采集速度：大于,100pts/,秒,升温速度：,0.1,o,C/,秒,2010,LS32,32,样品转盘,玻璃毛细管,HRM,检测,60,分钟内完成定量,PCR,和,HRM,检测,HRM,检测升温速度可以在,0.05,0.90,o,C/,秒之间调节,在升温速度小于,0.3,/,秒时，温度均一