,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,1,植物组织培养,第九章,植物遗传转化,2,植物基因工程是指把不同生物有机体的,DNA,（或基因）分离提取出来，在体外进行酶切和连接，构成,重组,DNA,（,Recombinant DNA,）分子,，然后转化到受体细胞（大肠杆菌）使外源基因在受体细胞中复制增殖，然后借助生物的或理化的方法将外源基因导入到植物细胞，进行转译或表达。,也称为植物遗传转化、植物转基因等。,1,植物基因工程的概念,3,植物基因工程是,80,年代开始兴起和发展起来的一门新技术，它是在分子遗传学的理论基础上，综合采用了分子生物学、微生物学和植物组织培养的现代方法和技术建立起来的。,转移的目的基因可从动物、人、植物或微生物中获取。,植物基因工程首先是随原核生物的基因工程的发展而得以发展。,大肠杆菌，酵母，动植物细胞,。,4,植物基因工程发展迅速。自从,1983,年首例转基因植物（烟草）诞生以来，现在已有,100,多种植物通过基因工程技术获得了转基因植株，包括,番茄、辣椒、茄子、马铃薯、胡萝卜、芹菜、莴苣、甜瓜、黄瓜、白菜、甘蓝、花椰菜、芥菜、石刁柏、洋葱、柑橘、柿、杨树、桉树,等。,5,2,植物基因工程的载体,Ti,载体,其它载体,RNAi,6,根癌农杆菌（,Agrobacterium tumefaciens,）的,Ti,质粒（,Tumor-inducing plasmid,）,的改建与利用，从而开创了植物基因工程的新纪元。,根癌农杆菌,7,8,9,10,T,DNA,11,植物基因工程中，我们把接受外源(目的)基因的生命体系称为,“,受体,”,。,受体包括：,叶圆片(盘)、胚性愈伤、胚状体、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等不同的形态。,其基本形态还是细胞。,叶圆片与农杆菌共培养是最简单的转化方法；愈伤组织的转化效率高、生长速度快，是快速检测外源基因表达的最好受体；原生质体则是单克隆转化的最佳材料。,3,植物基因转化的受体,12,转化植株,（,未）受精卵细胞,花粉,胚,胚轴,子叶,叶片,茎段,萌发种子,子房,原生质体,悬浮培养细胞,花器官,根,创伤植株,块茎,茎尖,植物基因转化的外植体,13,被转化的受体细胞是单个独立的细胞，为选择遗传均一性的转基因植株提供了可能性。,以悬浮细胞作受体的转化方法包括：,农杆菌介导法、基因枪法、,PEG,介导法、电激法和显微注射法等。,3.1,悬浮细胞,14,原生质体是无细胞壁的细胞。,与悬浮细胞一样，被转化的受体细胞是单个独立的细胞，为选择遗传均一性的转基因植株提供了可能性。,3.2,原生质体,15,愈伤组织容易大量制备,愈伤组织的转化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上获得成功。,用农杆菌介导法最适合。,3.3,胚性愈伤组织,16,胚状体是由愈伤组织经过改造后分化而来的，其转化方法与愈伤组织相同。,3.4,胚状体,17,叶圆片是农杆菌转化的主要受体。也称为叶盘法。,用打孔器或解剖刀切取直径3,5,mm,的叶圆片；,在液体培养瓶中与农杆菌共培养20-30,min,；,将叶圆片在滤纸上吸干；,转移到非选择性培养基上培养3,d,；,再移入含抗生素的选择培养基上培养；,诱导植株再生；,获得转基因植株。,叶盘法常见于双子叶植物的遗传转化。,3.5,叶圆片,18,如子叶、胚轴、茎段、根、体细胞胚、花粉等,3.6,其他受体,19,农杆菌介导法,(,Agrobacterium-mediated transformation),基因枪转化法,(,Microprojectile bombardment),聚乙二醇-介导法,(,PEG-mediated transfomation),电激法(,Electroporation),花粉管通道法,(,Pollen-tubepathway),显微注射法,(,Microinjection),脂质体转化,(,Liposomes transformation),激光微束转化法,(,Laser microbeam puncture),4,植物基因转化的方法,20,根癌农杆菌(,Agrobacterium tumefacience,),介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。,其,Ti,质粒(,Tumor-inducing plasmid),具有将,DNA,整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。,每个,Ti,质粒都有3个功能区域。一是,T-DNA,区，即转化,DNA,区，与病症发生有关的基因位于这个区，决定着肿瘤形态和冠瘿碱的合成；二是,Vir,区，是,T-DNA,区以外的与感染肿瘤有关的区域；三是分解和利用冠瘿碱的区域，分布着冠瘿碱分解酶基因。,4.1,农杆菌介导法,21,4.2,微弹轰击法,原理：,金属微粒在外力作用下达到一定速度后，可以进入植物细胞，但又不引起细胞致命伤害，仍能维持正常的生命活动。,也称为基因枪法。,利用这一特性，先将含目的基因的外源,DNA,同钨、金等金属微粒混匀，使,DNA,吸附在金属微粒表面，随后用基因枪轰击，使,DNA,随高速金属微粒进入植物细胞。,此方法可直接处理植物某器官或某组织，是当今普遍使用的植物转基因方法。,22,23,聚乙二醇介导法与,PEG,诱导原生质体融合的机理相似，不同的是后者发生在原生质体之间，而前者发生在原生质体与,DNA,之间。,在高浓度的二价钙离子(,Ca,2+,),和高,pH,值的条件下，略带负电的高分子,PEG,可能促进,DNA,向原生质体膜沉淀，或参与原生质体的内吞作用下，使外源,DNA,分子进入原生质体和细胞核，并整合到染色体上。,4.3,聚乙二醇-介导法,24,4.4,电激法,原理：,细胞膜的基本组成是磷脂，在适当的外加脉冲电场作用下，细胞膜被击穿，但还达不到细胞致命伤害。所以当移去外加电场后，被击穿的膜孔可自行复原。,也称为电穿孔法。,根据这一性质，植物原生质体同外源,DNA,分子混合，置于电击仪的样品室中，按预定的参数进行直流电脉冲处理，再通过常规的再分化培养和筛选，可获得转基因植株。,为避免制备原生质体和原生质体再生植株的困难，近来用此技术直接处理具有完整细胞壁的植物细胞、愈伤组织和花粉粒，均取得一定的效果。,25,26,27,4.5,花粉管通道法,原理：,将重组,DNA,涂于授粉的柱头上，使,DNA,沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化尚不具有正常细胞壁的卵、合子和早期的胚胎细胞，在活体内产生转基因种子。,28,花粉管通道法,29,4.6,显微注射法,原理：,利用显微注射仪将外源,DNA,直接注入受体的细胞质或细胞核中。,重要问题：必须把受体细胞进行固定。,动物细胞具有独特的贴壁生长待性，因此不存在固定细胞的问题。,植物细胞的显微注射必须建立固定细胞技术。目前有三种方法：,琼脂糖（低熔点）包埋法；多聚,-L-,赖氨酸粘连法；吸管（毛细管）支持法。,30,4.7,脂质体介导法,原理：,脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，把用来转染的,DNA,分子包在其中，通过脂质体与细胞接触，将外源,DNA,导人受体细胞。,包装成脂质体的,DNA,的转染串比裸露的,DNA,的转染率高出,100,倍。,如先用,PEG,处理培养,的受体细胞，使其易吸收培养基中的脂质体，可提高转染率,10,20,倍。,在正常情况下，每个细胞平均可吸收,1000,个左右的脂质体。,这是哺乳动物转基因研究中常用的方法之一。,31,4.8,激光微束穿孔法,原理：,利用直径很小（纳米级）、能量很高的激光微束可引起细胞膜可逆性穿孔的原理，在荧光显微镜下用激光处理细胞，处于细胞周围的重组,DNA,随之进入细胞。,此方法最适用于,活细胞中线粒体和叶绿体等细胞器的基因转移。,32,33,植株再生是基因转移的关键步骤，直接决定能否获得转基因植株。,两种形式：,一种是愈伤组织再生,另一种是直接再生，从外植体直接诱导出芽而不经过愈伤组织的分化。,转墓因植株再生的方式与一般植株再生的方式相同，主要区别是转基因植株的再生受外源基因、载体系统、抗生素、转化过程的影响。,5,转基因植株的再生及其检测方法,5.1,转基因植株再生,34,常采用报告基因作为标记，以便快速检测。,主要采用分子生物学方法检测，包括：,聚合酶链式反应(,PCR)、Southern,Blot,、,Northern Blot,和,Western Blot,等方法。,进行分子生物学检测以后还要进行生物学鉴定，以确定基因是否可以正常地表达性状，并稳定地遗传给后代。,如果一些有价值的目的基因被转入，还必须鉴定基因的功能及其表型。,5.2,转基因植株的检测,35,如转化抗病毒基因：,要对转基因植物进行病毒接种，以鉴定抗病毒能力。,若转化的基因为抗除草剂基因：,还要对植物喷洒除草剂进行检测。,若转基因植物是食用粮食作物或油料：,还要通过转基因植物的安全性检测，以免对人类和环境造成危害。,如果转化的是花色素合成酶基因：,则凭肉眼就可直观鉴定花色变化。,36,37,6,植物转基因产品的安全性,国际大讨论,38,斑蝶事件：,1999,年,5,月，康奈尔大学的一个研究组在,Nature,杂志上发表文章，声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫,“,马利筋,”,的杂草上，用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶，导致,44,的幼虫死亡。,现在这个事件也有了科学的结论：,第一，玉米的花粉非常重，扩散不远，在玉米地以外米，每一平方厘米马利筋叶片上只找到一个玉米花粉。,第二，,2000,年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁，实验室试验中用,10,倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫，也没有发现对其生长发育有影响。,斑蝶减少的真正原因，一是农药的过度使用，二是墨西哥生态环境的破坏。,39,加拿大“超级杂草”事件：由于基因漂流，在加拿大的油菜地里发现了个别油菜植株可以抗一种、两种或三种除草剂，因而有人称此为“超级杂草”。,事实上，这种油菜在喷施另一种除草剂,2,，,4-,后即被全部杀死。,应当指出的是，“超级杂草”并不是一个科学术语，而只是一个形象化的比喻，目前并没有证据证明已经有“超级杂草”的存在。,同时，基因漂流并不是从转基因作物开始，而是历来都有。如果没有基因漂流，就不会有进化，世界上也就不会有这么多种的植物和现在的作物栽培品种。,40,墨西哥玉米事件：,2001,年,11,月，美国加州大学伯克莱分校的两位研究人员在,Nature,上发表文章，声称在墨西哥南部,Oacaca,地区采集的个玉米地方品种样本中，发现有,CaMV 35S,启动子及,Novartis Btll,抗虫玉米中的,adh1,基因相似序列。,绿色和平组织借此大肆渲染，说墨西哥玉米已经受到了“基因污染”，甚至指责墨西哥小麦玉米改良中心的基因库也可能受到了“基因污染”。,文章发表后受到很多科学家的批评，。所谓测出的,35S,启动子，经复查证明是假阳性。所称玉米中的,adh1,基因已经转到了墨西哥玉米的地方品种，也是假的。,转入玉米中的基因序列是,adh1,-S,基因，而作者测出的是玉米中本来就存在的,adh1,-IF,基因，两者的基因序列完全不同，是两码事。显然作者没有比较这两个序列，审稿人和,Nature,编辑部也没有核实。,墨西哥小麦玉米改良中心（,CIMMYT,）也发表声明指出，经对种质资源库和新近从田间收集的,152,份材料的检测，在墨西哥任何地区都没有发现,35S,启动子。,41,中国抗虫棉破坏环境事件：,2003,年月日，南京环科所与绿色和平组织在北京召开会议，月日,China Daily,上发表了题为,“,GM Cotton Damage Environment,”的文章，亦即“转基因抗虫棉破坏了环境”。,绿色和平组织也于当天在其网站上刊登了南京环科所、绿色和平组织顾问薛达元先生长达,26,页的英文报告，从而再次引发国际争论，在欧、美产生巨大反响，成为国际上争论转基因作物安全性的重大事件之一。,42,6,月,5,日德国农业报发表了题