单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,真核生物,DNA,修复机制,董霞 蒋舜媛 程在全,DNA,损伤,错配,紫外线,电离辐射,化学试剂,致病、致死,进化,复制过程,修复,真核生物,DNA,的修复机制,重组修复,非同源末端连接修复,跨越修复,切除修复,一,.,真核生物,DNA,损伤的重组修复,同源重组的重要性,染色体重组及重组修复的有关蛋白,酵母影响同源间重组的途径,酵母菌中复制导致的染色体片段化,酵母菌重组修复的机制,脊椎动物细胞的重组修复,同源重组的重要性,According to the participants of the National Academy of Sciences Colloquium entitled Links Between Recombination and Replication:Vital Roles of Recombination,organized by Charles,Radding,(chair),Nicholas,Cozzarelli,Michael Cox,Kenneth Marians,and James,Haber,and held at the Beckman Center of the Academy in Irvine,California,on November 10-12,2000.,The recent surge in works on interdependence of DNA replication and homologous recombination,conducted in experimental systems ranging from,bacteriophages,to mammalian cell lines,highlighted faltering replication forks as the connecting points between the two seemingly opposite domains of DNA metabolism.,Proc.Natl.Acad.,Sci,.USA,Vol.98,Issue 15,8461-8468,July 17,2001,Colloquium Paper,DNA replication meets genetic exchange:Chromosomal damage and its repair by homologous recombination Andrei,Kuzminov,*,染色体重组及重组修复的有关蛋白,染色体的同源重组是重组修复的基础。,(,fig32,),酵母中重组相关蛋白与,phage T4,、大肠杆菌的比较，通过对重组缺陷突变体的研究,揭示,DNA,代谢在跨不同领域的明显的相似性，分析了相应重组酶及有关蛋白质的特征,(,fig33,),如,PCNA(,fig38,),。当单链,DNA,断裂不能复制时，就引发同源重组。,酵母中影响同源性重组的途径,A.,RAD51/54/55/57,作用于同源重组之间,强烈影响同源染色体间的重组,.,B.,rad50,mre11,(,rad58,),rad59,and,xrs2,(,rad60,),作用于姊妹重组之间,RAD50/58/59/60,途径轻微提高同源间重组的水平,.,它们都受,RAD52,的控制,酵母菌中复制导致的染色体片段化,A:,点检测,真核生物复制及修复过程中精确的点检测方式阻止了细胞周期以避免,DNA,的明显损伤，阻止停滞不前的复制叉的大量出现，从而产生染色体片段化，然后或细胞停止分裂或有助于重组修复的形成。,Mec1,是一个依赖于,RAD52,的,DNA,损伤的点检测关键蛋白,.,它,的突变在新合成,DNA,中积累单链断裂,B:,当出芽酵母细胞用羟基尿抑制核苷酸还原酶,细胞中的,DNA,会集聚单链断裂,.,单链断裂转换为双链断裂也使,DNA,片段化，这一些现象最直接的解释是原来有单链断裂的,DNA,上复制叉解散,(,Fig.2,B,-,C,),出现断裂双链。,rad27,pol30,rfc1,cdc9,突变,DNA,单链断裂积累,冈崎片段不能成熟突变,双链,DNA,不能修复,致 死,C:,冈崎片段不能成熟的突变导致,DNA,片段化,D:Michael,Resnick,和,Dmitry,Gordenin,报道了一系列,DNA,聚合酶,突变体中，如果再加上,rad27,突变，缺乏,35,核酸外切酶活性,这种突变是致死的。但是,DNA,聚合酶,突变体中,如果具有,Rad27,和,3-5,Exo,of,Pol,（聚合酶的,3-5,核酸外切酶活性）,这样的突变体仍能存活，不过会发生超重组，超重组依赖于,RAD50,RAD51,和,RAD52.,这种情况下冈崎片段有可能不能成熟,也出现,DNA,片段化。,酵母菌重组修复的机制,A,、暂停复制叉修复的假说,(,fig,),B,、链退火修复复制叉,依靠单链退火修复复制叉的两种途径 复制叉到达模板,DNA,的单链断裂后解体,Rad52,促进染色质上带有单链裂缝的分离末端的重新退火。单链断裂的修复 全长染色质上的单链断裂得到填补，,Rad54,催化完整染色质在双链末端临近位置的解链。,Rad52,催化一条单链与打开的姊妹链的双链之一的末端退火，从而产生复制叉结构。,(,fig35,),C:,酵母菌的双链断裂重组,酵母菌的双链断裂重组有两个阶段：,1,、末端之一侵入到同源染色体，形成类似于复制叉的重组中间体，,2,、另一末端的聚集阻止了重组中间体形成复制叉,.,如果因为同源性有限，第二个末端不能与重组中间体结合，复制叉成熟，继而推进到染色体末端。,D,、双链末端修复的发生顺序假说,双链末端被,Rad50/Rad58/Rad60,加工产生,ssDNA,突出，与,RPA,形成复合体,;,Rad52,催化,RPA,与,Rad51,的转化；,Rad51,在,Rad54,Rad55,和,Rad57,的帮助下，催化双链末端侵入完整的姊妹双链。,在这一机制中,Rad51,作为蛋白质复合体的组成者和催化剂两方面起着重要的作用,(,fig41,),。,脊椎动物细胞的重组修复,重组修复机制与酵母大致相同，只是要复杂些。多数双链断裂被同源重组如实修复，这一重组机制是通过缩短断裂一端的同源 序列长度 实验证实的：得到的修复产物携带着断裂的非同源一端的多种拷贝。在复制区内及前后，有很多微小同源区。显然，断裂的同源末端侵袭完整的姊妹染色单体，启动复制叉，产生的末端在微小同源区与非同源末端相连。,Proc.Natl.Acad.,Sci,.USA,Vol.98,Issue 15,8388-8394,July 17,2001,Colloquium Paper,Homologous DNA recombination in vertebrate cells,Eiichiro,Sonoda,*,Minoru,Takata,*,Yukiko M.,其它差异：,A,、用鸡淋巴瘤细胞株为材料做的突变实验，发现不同于酵母的两个主要变异：,1,、,rad51,突变脊椎动物细胞迅速死亡，死之前发育中的全部染色体发生变异。,2,、脊椎动物的,rad52,突变体细胞对,DNA,损伤剂不是太敏感。,B,、脊椎动物与酵母的另一个差异是：脊椎动物中存在多种共生同源的重组酶蛋白,Rad51p,。,XRCC2,是,Rad51p,的一个共生同源物，但非同源末端的连接不受影响。,XRCC3,是,Rad51p,的另一个共生同源物，通过同源重组对双链突变的修复需要它。,同 源 重 组,DNA,复制使先前存在的,DNA,损伤恶化，因而阻碍了以后,DNA,的复制。需要同源重组帮助修复,DNA,损伤引起复制叉失控使复制体具有断裂的倾向,同源重组使单链断裂和双链断裂经过复制叉的解体和重新形成而得到修复。,真核生物重组酶对真核生物单链退火有较大的作用。,近期的报道认为,RAD51,在真核中起关键作用,.,二,.,非同源末端连接,(,NHEJ),修复,A1 B1,A2 B2,同源片段,A1/A2;,同源片段,B1/B2,如果,A1,的末端和,B1,的末端连接,可进行,非同源末端连接修复,依靠,Ku,类蛋白质,而不是象,HR,修复依靠,RAD52,非等位基因编码的蛋白质,.,事实上,在,NHEJ,中,仍然存在着一些微小的同源小区域,帮助,NHEJ.,在酵母菌和脊椎动物中,DSB,修复途径存在一些差异,.,HR,、,NHEJ,在酵母菌和脊椎动物中,DSB,的作用,NHEJ HR,酵母菌,+,脊椎动物,+,三,.,跨越修复,跨越修复 在,RPA,、,Rad,、,DNA,聚合酶、,PCNA,等的作用下，使新生的,DNA,跨越模,板上错误的碱基而继续合成。,最近新发现的,UmuC-PinB-Rad30-Rev1,复合体在三种生物域都存在,.,它们在跨越损伤修复中起重要作用,.,机制一,(,fig36,),机制二,(,fig39,),Biochem.Soc,Trans May29(Pt 2):187-91,Eukaryotic mutagenesis and,translesion,replication dependant on,DNA polymerase zeta and Rev1 protein,四,.,切除修复,切除修复是一种多步骤的酶反应过程,(,fig37,),核酸内切酶将损伤的,DNA,切除 由,DNA,聚合酶进行聚合反应填补修复的切口,由,DNA,连接酶连接,完成修复,切除修复分为核苷酸切除修复,(NER),和碱基切除修复,(BER).,而,BER,又分为短补丁,(1,个核苷酸,),修复和长补丁,(2-10,个核苷酸,),修复,.,Mutut,Res,2001.Sep.4.486(4):217-47,Repair of DNA,interstrand,cross-links,DNA,interstrand,interstrand,cross-links(,TCLs,)are very toxic to dividing cells,多种途径如,NER,、,HR,转录后复制,/,跨损伤修复都参与,DNA,的,ICLs,修复,Crit,Rev,Biochem,md,.Biol.2001 36(4):337-97,Molecular mechanisms of DNA damage and repair:progress in plants,植物主要受,OV-B,射线影响，导致过氧化损伤和交叉连接（,DNA-Pr,、,DNA-DNA,）修复方式有：直接反转、,BER IVER,光修复、跨越修复、双链断裂途径错配修复途径,直接反转修复、光修复只需要,1,种蛋白参与，其它修复方式要求多种蛋白参与。,双链断裂需要,HRR,或,NHEJ,，而在植物中，,NHEJ,导致错误修复几率比其它真核生物的高，从而产生进化。,BER,：单核苷切除途径：依赖,DNA,pol,多核苷（,2-10nt,）切除：需,PCNA,Cell Death Differ 2001.Nov.8(11):1076-92.,Functional interactions and signaling properties of mammalian DNA mismatch repair proteins,PCNA:proliferating cell nuclear antigen:ringmaster of the genuine,PCNA,是决定细胞存活与死亡的关键分子之一，,PCNA,基因可由,P53,诱导。如果,PCNA,量丰富，无,P53,，进行,DNA,复制；如果,PCNA,量丰富，有,P53,，进行,DNA,修复；如果,PCNA,量低，无,P53,，细胞编程序性死亡。,PCNA,：低等原核生物中只是滑动夹状蛋白，而在