,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质一级结构（,primary structure,）的测定,蛋白质一级结构（primary structure）的测定,蛋白质测序,的,发展简史,自从,1953,年,Sanger,首次完成胰岛素的氨基酸顺序测定以来，目前已有很大改进。但是,Sanger,花费多年时间才基本搞清胰岛素的一级结构，现在由于方法改进及自动化分析仪器的产生，现在已有数百种蛋白质的氨基酸序列问世。,蛋白质测序的发展简史,氨基酸序列测定的基本步骤（化学方法）,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,测定多肽链的氨基末端和羧基末端,为何种氨基酸,把肽链水解成片段,测定各肽段的氨基酸排列顺序,综合运用多种水解法分析肽段中的氨基酸顺序,氨基酸序列测定的基本步骤（化学方法）分析已纯化蛋白质的氨基酸,测序前的准备工作,要求：,样品纯度：,97%,以上,相对分子质量：允许误差在,10%,左右,（一）多肽链的拆分,几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质；可用,8mol/L,尿素或,6mol/L,盐酸胍或高浓度的盐处理，即可使寡聚蛋白质中的亚基。,如果多肽链间通过共价键（,S,S,）连接在一起，可采用氧化剂或还原剂将其断裂。,（二）测定蛋白质分子中多肽链的数目,通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,（三）二硫键的断裂,几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在,8mol/L,尿素或,6mol/L,盐酸胍存在下，用过量的,-,巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防它重新被氧化。,测序前的准备工作要求：,一、氨基酸组成,蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分开，测定它们的量，算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或个数。,一、氨基酸组成 蛋白质经盐酸水解后成为个别,蛋白质多肽链氨基酸序列的测定课件,二、末端测定的具体方法,化学法,二硝基氟苯法（,DNP,法）,二甲基氨基萘磺酰氯法,（,Dansyl-,氯法）,肼解法,还原成氨基醇法,酶解法,亮氨酸氨肽酶法,细胞外氨肽酶法,羧肽酶,A,法,羧肽酶,B,法,羧肽酶,C,法,二、末端测定的具体方法,二硝基氟苯法,(Sanger,法）,2,4-,二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链,N-,端的游离氨基作用，生成黄色二硝基苯衍生物（,DNP-,氨基酸）,二硝基氟苯法(Sanger法）2,4-二硝基氟苯在碱性,氨基肽酶法,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的,N-,端逐个地向里水解。,根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的,N-,端残疾顺序,氨基肽酶法氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个地,C-,末端之肼解法,多肽与肼在无水条件下加热，,C-,端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与,C-,端氨基酸分离。,肼解过程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破坏而不易测出，,C-,末端的精氨酸转变为鸟氨酸,C-末端之肼解法多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽,羧肽酶法,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的,C-,端逐个地水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的,C-,端残疾顺序,羧肽酶,来源,专一性,CpA,胰脏,能释放除,Pro,、,Arg,、,Lys,外的所有的,C-,端氨基酸,CpB,胰脏,主要水解,C-,端为,Arg,、,Lys,的肽键,CpC,植物或微生物,相当广泛，几乎能释放,C-,端的所有氨基酸,羧肽酶法羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个地水,还原成氨基醇法,多肽,C-,端氨基酸可被硼氢化锂（,LiBH4,）还原成,-,氨基醇，用层析法可以鉴定氨基酸种类。,Sanger,早期测定胰岛素,C-,末端氨基酸采用此法。,还原成氨基醇法多肽C-端氨基酸可被硼氢化锂（LiBH4）还原,三、水解肽链成肽段,水解酶或化学试剂,水解部位,作用的氨基酸,胰蛋白酶,羧基侧,赖氨酸、精氨酸,胰凝乳蛋白酶,羧基侧,芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）,溴化氰,羧基侧,甲硫氨酸,水解后得到的肽段，可用离子层析或其他层析方法将其分离纯化。比如用双向电泳可以得到肽图，由此可知肽段的多少。,三、水解肽链成肽段水解酶或化学试剂水解部位作用的氨基酸胰蛋白,四、,Edman,降解法测定肽段的氨基酸序列,耦联：,使用苯异硫氰酸酯（,PITC,）在,pH9.0,的碱性条件下对蛋白质或多肽进行处理，,PITC,与肽链的,N-,端的氨基酸残基反应，形成苯氨基硫甲酰（,PTC,）衍生物，即,PTC-,肽。,水解：,PTC-,肽用三氟乙酸处理，,N-,端氨基酸残基肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。,四、Edman降解法测定肽段的氨基酸序列,萃取：,将该衍生物用有机溶剂（例如氯丁烷）从反应液中萃取出来，而去掉了一个,N-,端氨基酸残基的肽仍留在溶液中。,转化：,萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用，再进一步环化，形成一个稳定的苯乙内酰硫脲（,PTH,）衍生物，即,PTH-,氨基酸。,Edman,降解法测序每次只能测定几十个氨基酸残基，所以要测定较大蛋白质的氨基酸序列，需要将其降解为一些肽段，经,HPLC,分离出各个肽段，然后再进行,Edman,降解测序。,萃取：,五、鉴定每个肽段氨基酸顺序,ABCDE,*ABCDE,部分水解,*,A,*AB,*ABC,*ABCD,*ABCDE,完全水解,*,A,*A+B,*A+B+C+D+E,DNFB,*A,*A+*B,*A+*B*+*C+*D+*E,肽段经过分离纯化后，即可进行氨基酸测序。但是获得数据之后，还不能得出整条多肽链的氨基酸排列顺序，因为尚不清楚这些片段在多肽链中的先后次序。一般需要用到多种水解法，并分析出各肽段的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中的氨基酸序列。,五、鉴定每个肽段氨基酸顺序ABCDE 肽段经过分离,六、确定肽段在多肽链中的次序,利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。,多肽,氨基酸序列,重叠法：小片段重叠的原理,主要用于,一级结构的测定,六、确定肽段在多肽链中的次序 利用两套或多套肽段的氨基酸,七、确定原多肽链中二硫键的位置,一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质,选用该法的好处：,该酶的专一性比较低，切点多，生成肽段包括含有二硫键的肽段比较小，对后面的分离、鉴定比较容易；,该酶的作用,pH,在酸性范围，有利于防止二硫键发生交换而造成的麻烦。,七、确定原多肽链中二硫键的位置 一般采用胃蛋白酶水解原来,反向遗传法分析多肽链的氨基酸序列,基本原理：中心法则,基本步骤：,1,、分离编码蛋白质的基因,2,、测定,DNA,序列,3,、排列,mRNA,出序列,4,、按照三联密码原则推演氨基酸序列,反向遗传法分析多肽链的氨基酸序列基本原理：中心法则,为什么进行蛋白质测序,?,基因组测序,为了破译遗传密码,.,现在密码已破,那进行蛋白质组测序有必要吗,?,基因研究贯穿了整个,20,世纪,100,多年里,双螺旋结构的提出,中心法则的发现,直至基因组的重大突破,使基因研究达到了前所未有的深度与广度,.,然而,基因只是信息的携带者,蛋白质才是执行者,.,基因组计划有其固有的局限性,基因组测序是否正确,要从其表达的蛋白来验证,否则,只是一堆乱码而已,.3.5,万左右基因中一半以上是理论推断,需要从蛋白质角度确认,.,而且,从蛋白质研究的自身发展来看,我们无法逃避蛋白质组表达谱分析,只是时间问题而已,.,以前,对蛋白质的研究是优于基因的,因为,PCR,测序自动化使其发展猛,.80,年代末,Hillen Kamp,发展的激光解析质谱,Fem J,设计的电喷雾质谱可以高效,精确的测量生物大分子的质量,并测定部分序列,进而用于数据库的检索,.Mann M,等再此基础上通过建立,肽质量指纹图谱与肽序列标签,等技术实现了质谱对蛋白质进行大规模准确快速自动化的测序,.,结构生物学是生命科学领域又一个新的研究热点，飞速发展的蛋白质结构分析技术是研究蛋白质功能的基础。随着蛋白质组时代的来临，许多基因组分析留下的悬而未决的问题，可能通过直接的蛋白质的分离和鉴定而得到解决。,为什么进行蛋白质测序?基因组测序,为了破译遗传,蛋白质一级结构的比较可以揭示进化的关系,蛋白质一级结构是由编码它的基因确定的，蛋白质一级结构之间的差别可以反映出进化关系。亲缘关系密切的蛋白质的氨基酸序列非常类似，一级结构中氨基酸残基序列差别越大，它们的亲缘关系就越远。细胞色素,c,是由一条含有,104,至,111,个氨基酸残基的多肽链组成的，由于细胞色素,c,几乎存在于所有的需氧生物中，所以通过在分子水平上比较来自不同种属的细胞色素,c,，可以看出它们之间的进化关系。,蛋白质一级结构的比较可以揭示进化的关系,