,单击此处编辑母版标题样式,级,#,第六章 分子生物学基本研究法（下）,基因功能研究技术,第六章 分子生物学基本研究法（下）基因功能研究技术,1,基因表达研究技术,基因敲除技术,蛋白质及,RNA,相互作用技术,基因芯片及数据分析,利用酵母鉴定靶基因功能,其他分子生物学技术,基因表达研究技术,2,6.1,基因表达研究技术,6.1.1,基因表达系列分析技术（,Serial Analysis of Gene Expression,，,SAGE,）,以,DNA,序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术。,任何长度超过,9-10,个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物。因此，可用特定限制性核酸内切酶分离转录产物中具有基因特异性的,9-10,个碱基序列并制成标签。,将,10-50,个序列标签连接、克隆、测序后，根据其占总标签数的比例即可分析所对应编码基因的表达频率。,6.1 基因表达研究技术6.1.1 基因表达系列分析技,3,常规,SAGE,方法（,short SAGE,）基本流程,连接子,1,和连接子,2,的,5,端分别加有氨基，以防止,5,端相连接。,分离提取合成,cDNA,用锚定酶,AE,消化,分,3,端酶切,两份，分别与,S,类,TE,标签酶识别位点结合。,标签酶,TE,酶切,末端补平,连接两份，根据接头,1,、,2,设计引物进行,PCR,得到双标签，分离纯化串联入载体。,连接,10-50,个标签进行克隆，测序，分析,常规SAGE方法（short SAGE）基本流程分离提取合,4,LongSAGE,技术,传统的,SAGE,技术用,14,个碱基的标签代表一个基因并不能覆盖人类基因组内所有的基因序列，因而又发展了,LongSAGE,技术。,LongSAGE,标签来自转录物,3,端一段,21bp,的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。,其原理与传统的,Short,SAGE,方法类似，只是用了不同的,S,类标签酶（,Mme,I,），并将程序做了相应修改。,LongSAGE技术传统的SAGE技术用14个碱基的标签代表,5,6.1.2 RNA,的选择性剪接技术,RNA,的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个,mRNA,前体中产生不同的,mRNA,剪接异构体的过程。可分为：,平衡剪切；,5,选择性剪切；,3,选择性剪切；,外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。,常用,RT-PCR,法（反转录,PCR,）研究某个基因是否存在选择性剪切。,RT-PCR,：把,RNA,提取后反转录成,cDNA,，并以其为模板进行的,PCR,反应。,6.1.2 RNA的选择性剪接技术RNA的选择性剪接是指,6,平衡剪切,5,选择性剪切,3,选择性剪切,外显子遗漏型剪切,相互排斥性剪切,平衡剪切5选择性剪切3选择性剪切外显子遗漏型剪切相互排斥,7,一般用,RT-PCR,法研究一个基因是否存在选择性剪接。选择性剪接使一个基因翻译为多种蛋白质序列。分析人类基因组数据发现,60%,的基因在表达中可通过选择性剪接产生各种形式的,mRNA,。,一般用RT-PCR法研究一个基因是否存在选择性剪接。选择性剪,8,该基因编码一个神经无轴突定向受体，,4,号外显子有,12,个变异体，,6,号外显子有,48,个变异体，,9,号外显子有,33,个变异体，,17,号外显子有,2,个变异体。推测该基因共有,1248332=38016,剪接异构体。,该基因编码一个神经无轴突定向受体，4号外显子有12个变异体，,9,6.1.3,原位杂交技术,原位杂交,(In Situ Hybridization,，,ISH),是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射 检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体 上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手 段，分为两大类：,RNA,原位杂交,染色体原位杂交,6.1.3 原位杂交技术原位杂交(In Situ Hy,10,RNA,原位杂交：一般用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定 的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的,mRNA,分子，两者杂交产生双链,RNA,，就可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基 因的表达产物做出定性定量分析。,RNA原位杂交：一般用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）,11,用组织原位杂交技术检测棉花纤维特异基因的表达,用组织原位杂交技术检测棉花纤维特异基因的表达,12,荧光原位杂交,(fluorescence in situ hybridization,，,FISH),首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或,DNA,上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该,DNA,序列在染色体上的位置。,荧光原位杂交(fluorescence in situ hy,13,6.1.4,基因定点突变,(site-directed mutagenesis),该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造,DNA,调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。,迄今尚未建立用于精确预测特定氨基酸变化对整个蛋白结构及活性影响的模型，即使了解一个蛋白质的三维结构，也无法了解某个氨基酸残基对其的影响。而基因定点突变为进一步了解蛋白质的结构与功能的关系提供了重要的手段。,6.1.4 基因定点突变(site-directed m,14,70,年代初，,Smith,等建立了体外寡核苷酸介导的,DNA,突变技术，提高了突变效率。,70年代初，Smith等建立了体外寡核苷酸介导的DNA 突变,15,目前，主要采用两种,PCR,方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点 突变。,重叠延伸介导的定点诱变机制：,目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在,16,图,6-7,重叠延伸介导的定点诱变机制,首先模板,DNA,分别与,引物对,1,（正向诱变引物,FM,和反向引物,R2,）及,引物对,2,（正向引物,F2,和反向诱变引物,RM,）退火，通过,PCR1,和,2,反应扩增出两种靶基因片段。,然后，在,PCR3,反应中变性后的,FMR2,和,RMF2,片段在重叠区发生退火，按虚线所示进行延伸，形成全长双链,DNA,。,FMR2,RMF2,图6-7 重叠延伸介导的定点诱变机制首先模板DNA分别与引物,17,首先用正向突变引物（,M,）和反向引物（,R1,），扩增模板,DNA,产生双链大引物（,PCR1,），与野生型,DNA,分子混合后退火并使之复性，第二轮,PCR,中加入正向引物（,F2,），与,PCR1,中产生的一条互补链配对，扩增产生带有突变的双链,DNA,。,首先用正向突变引物（M）和反向引物（R1），扩增模板DNA产,18,6.2,基因敲除技术,6.2.1,基本原理,经典遗传学（,Forward genetics,）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而 找出该基因的编码序列。,现代遗传学（,Reverse genetics,，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。,6.2 基因敲除技术6.2.1 基本原理经典遗传学（F,19,基因敲除（,gene knock-out,）又称基因打靶：,通过外源,DNA,与染色体,DNA,之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有 专一性强、染色体,DNA,可与目的片段共同稳定遗传等特点。,基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶：,20,基因敲除分为：,完全基因敲除,条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）,完全基因敲除：指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性；,条件型基因敲除：指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。,基因敲除分为：,21,关于基因敲除技术，噬菌体的,Cre/Loxp,系统、,Gin/Gix,系统、酵母细胞的,FLP/FRT,系统和,R/RS,系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以,Cre/Loxp,系统应用最为广泛。,关于基因敲除技术，噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gi,22,1,、完全基因敲除：,Neo,基因有双重作用：形成靶位点的插入突变；作为正向筛选标记。,取代型,插入型,1、完全基因敲除：取代型插入型,23,由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率约为,10,-2,10,-5,，植物的概率为,10,-4,10,-5,，即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞中筛选出真正发生 了同源重组的胚胎干细胞。,所以，得用多种,PCR,及,Southern,杂交等多种分子筛选技术验证所获得的确实是目的基因被敲除的细胞系。,由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率约为1,24,2,、条件型基因敲除：,完全基因敲除往往导致胚胎死亡；而条件型基因敲除，由于具有可调节性而受到科学家的重视。,特点：常将正向选择标记,neo,r,置于内含子中。,2、条件型基因敲除：,25,6.2.2,高等动物基因敲除技术,真核生物基因敲除的技术路线主要包括：,构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组,DNA,导入胚胎干细胞纯系中。,使外源,DNA,与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的,DNA,序列整合到内源基因组中并得以表达。,主要实验流程及筛选步骤：,6.2.2 高等动物基因敲除技术真核生物基因敲除的技术路,26,模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。,胚胎干细胞,(embryonic stem cell,ES),回交,显微注射筛选后的,ES,细胞,注入母体,重组载体中的,DNA,整合到内源基因组中得以表达,将正向选择标记,neo,r,置于载体中,与,ES,细胞重组,筛选重组后的,ES,细胞,模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。胚胎干细胞(,27,显微注射命中率较高，技术难度相对大些。,电穿孔法命中率比显微注射低,，操作使用方 便。,胚胎干细胞（,ES,细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。,显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注,28,6.2.3,植物基因敲除技术,T-DNA,插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。,利用根癌农杆菌,T-DNA,介导转化，将带有,报告基因,的,DNA,序列整合到基因组,DNA,上，如果这段,DNA,插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因,“,失活,”,。,T-DNA,：,是农杆菌,Ti,或,Ri,质粒中的一段,DNA,序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中，已成为植物分子生物学中广泛应用的,遗传转化载体,，,是,Ti,质粒上的片断,。,Ti,质粒因为自身一些优点很适合作为导入外源基因的载体。,报告基因：,是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个表达产物非常容易被鉴定的基因。,6.2.3 植物基因敲除技术T-DNA插入失活技术是目前,29,a.,引物设计,。,LP,和,RP,分别代表插入基因两端的,引物,，,LB,是指载体上的一段 引物，目的基因片 段,(,设为,900bp),。,旁邻序列,是经测序后获得的,DNA,序列。,b,，,PCR,产物电泳结果。,分别代表野生 型、杂合子和纯合 子,PCR,条带。,由,T-DNA,介导,目的基因片段,LB,为插入载体的引物,PCR,产物电泳结果,整合,导致基因失活,已知序列,通过设计引物分离靶基因,a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB 是,30,6.3,蛋白质及,RNA,相互作用技术,6.3.1,酵母单杂交系统（,Yeast one-hybrid system,）,是上世纪,90,年代中发展起来的研究,DNA-,蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于,DNA,上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核生物中,DNA-,蛋白质之间的相互作用，并通过筛选,DNA,文