,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2014-10-17,#,DNA,重组及重组,DNA,技术,第 二十一 章,DNA重组及重组DNA技术第 二十一 章,DNA,重组,（,DNA recombination,）是指不同,DNA,分子断裂和连接而产生,DNA,片段的交换并重新组合形成新,DNA,分子的过程。,重组,DNA,技术,（,recombinant DNA technology,）是指在体外将两个或两个以上,DNA,分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新,DNA,分子的过程。,2,DNA重组（DNA recombination）是指不同DN,第一节,自然界的,DNA,重组和基因转移,第一节自然界的DNA重组和基因转移,DNA,重组,4,同源重组,(homologous recombination),位点特异重组,(site-specific recombination),转座重组,(transposition recombination),接合作用,(conjugation),转化作用,(transformation),转导作用,(transduction),DNA重组4同源重组 (homologous recombi,第二节 重组,DNA,技术,第二节 重组DNA技术,重组,DNA,技术的发展史,1865,年,G.J.Mendel,的豌豆杂交试验。,1944,年,O.T.Avery,的肺炎球菌转化实验。,1973,年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组,DNA,分子。,1977,年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗,传工程公司，专门应用重组,DNA,技术制造医学上重,要的药物。,1980,年 开始建造第一家应用重组,DNA,技术生产胰岛素的工,厂。,1997,年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。,6,重组DNA技术的发展史1865年 G.J.Mendel的豌,21 DNA重组及重组DNA技术_课件,21 DNA重组及重组DNA技术_课件,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割,DNA,DNA,连接酶,催化,DNA,中相邻的,5,磷酸基和,3,羟基末端之间形成磷酸二酯键，使,DNA,切口封合或使两个,DNA,分子或片段连接,DNA,聚合酶,合成双链,cDNA,分子或片段连接；缺口平移制作高比活探针；,DNA,序列分析；填补,3,末端,Klenow,片段,又名,DNA,聚合酶,I,大片段，具有完整,DNA,聚合酶,I,的,5,3,聚合、,3,5,外切活性，而无,5,3,外切活性。常用于,cDNA,第二链合成，双链,DNA 3,末端标记等,反转录酶,合成,cDNA,；替代,DNA,聚合酶,I,进行填补，标记或,DNA,序列分析,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5,羟基末端磷酸化，或标记探针,末端转移酶,在,3,羟基末端进行同质多聚物加尾,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,9,一、重组,DNA,技术中常用的工具酶,工 具 酶功 能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DN,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease, RE),是一类核酸内切酶，能识别双链,DNA,分子内部的特异序列,并裂解磷酸二酯键。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,10,限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction e,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,H,in,d,属,系,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,11,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；命名：Hin d,类酶识别序列特点,回文结构,(palindrome),切口：,平端切口、粘端切口,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,12,类酶识别序列特点回文结构(palindrome),Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,黏端切口,13,Bam HGTCGGATCC+GGATCCHindGTC,定义,为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些,DNA,分子。,载体按功能分为,克隆载体,(cloning vector),：为使插入的外源,DNA,序,列被扩增而特意设计的载体称为,克隆载体,。,表达载体,(expression vector),：为使插入的外源,DNA,序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为,表达载体,。,14,二、重组,DNA,技术中常用的载体,定义 载体按功能分为14二、重组DNA技术中常用的载体,质粒,(plasmid),：,能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,常用的克隆载体,15,质粒(plasmid)：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些,pUC18,质粒载体图谱,16,pUC18质粒载体图谱16,17,原核表达载体的基本组成,R,：调节序列；,P,：启动子；,SD,：,SD,序列；,TT,：转录终止序列,表达载体,17原核表达载体的基本组成R：调节序列；P：启动子；SD：S,18,真核表达载体的基本组成,Ori,Pro,：,原核复制起始序列；,P,：,启动子；,MCS,：,多克隆位点；,TT,：,转录终止序列；,ori,euk,：,真核复制起始序列。,18真核表达载体的基本组成 OriPro：原核复制起始,基本原理,目的基因的获取 克隆载体的选择和构建,外源基因与载体的连接,DNA,导入受体细胞,重组体的筛选 克隆基因的表达,19,三、重组,DNA,技术的基本原理,及操作步骤,基本原理目的基因的获取 克隆载体的选择和构建外,以,质,粒,为,载,体,的,DNA,克,隆,过,程,20,以20,21,目的基因的分离获取,分,载体的选择与构建,选,目的,DNA,与载体连接,接,重组,DNA,转入受体细胞,转,重组体的筛选与鉴定,筛,克隆基因的表达,21目的基因的分离获取分,22,（一）目的基因的分离获取,分,1.,化学合成法,已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸,序列 。,2.,从基因组,DNA,文库和,cDNA,文库中获取目的,DNA,3. PCR,法,4.,其他方法,22（一）目的基因的分离获取分1.化学合成法,23,（二）载体的选择与构建,选,DNA,克隆的目的：,化学合成法获得某一目的基因或,DNA,片段,获得目的,DNA,片段所编码的蛋白质,23（二）载体的选择与构建选DNA克隆的目的：,载体,插入,DNA,片段,宿主细胞,质粒,510kb,细菌，酵母,噬菌体载体,20kb,细菌,黏粒,50 kb,细菌,BAC,400kb,细菌,YAC,3 Mb,酵母,24,不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞,载体插入DNA片段宿主细胞质粒510kb细菌，酵母噬菌,25,1.,黏端连接,(1),单一相同黏端连接,(2),不同黏端连接,(3),通过其他措施产生黏端进行连接,（三）目的,DNA,与载体连接,接,251. 黏端连接（三）目的DNA与载体连接接,Bam,H,切割反应,GGATCC,CCTAGG,T,4,DNA,连接酶,15,C,GATCC,G,G,CCTAG,+,目的基因用,Bam,H,切割,载体,DNA,用,Bam,H,切割,重组体,载体自连,目的基因自连,26,单一相同黏端连接,Bam H切割反应 GGATCCT4 DNA连接酶,Eco,R,切割位点,Bg,l,切割位点,+,Eco,R+,Bg,l,双酶切,Eco,R+,Bg,l,双酶切,T,4,DNA,连接酶,15,C,重组体,27,不同黏端连接（定向克隆）,Eco R切割位点Bg l切割位点+EcoR+ Bg,Eco,R,Eco,R,Eco,R,CCGAATTCG,GGCTTAAGC,5,-,3-,Eco,R,28,人工接头及其应用,Eco REco REco RCCGAATTCG 5,5,3,3,5,载体,DNA,5,3,3,5,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5,3,3,5,5,3,T(T),n,T,T(T),n,T,3,5,5,3,3,5,3,A(A),n,A,A(A),n,A,3,5,-,核酸外切酶,-,核酸外切酶,末端转移酶,+,dATP,末端转移酶,+,dTTP,T(T),n,T,A(A),n,A,A(A),n,A,T(T),n,T,T,4,DNA,连接酶,15,C,重组体,5,29,同聚物加尾连接,53载体DNA53目的基因限制酶或机械剪切限制酶,目的基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T,4,DNA,连接酶,15,C,重组体,载体自连,目的基因,自连,30,2.,平端连接,目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶重组体,31,受体菌条件：安全宿主菌,限制酶和重组酶缺陷,处于感受态,(competent),导入方式：,转化,(transformation),转染,(transfection),感染,(infection),（四）重组,DNA,转入受体细胞,转,31受体菌条件：安全宿主菌,32,1.,借助载体上的遗传标志进行筛选,2.,序列特异性筛选,3.,亲和筛选法,（五）重组体的筛选与鉴定,筛,321. 借助载体上的遗传标志进行筛选（五）重组体的筛选与鉴,插入失活筛选带有重组载体的克隆,33,插入失活筛选带有重组载体的克隆33,互补筛选（蓝,-,白筛选）,34,互补筛选（蓝-白筛选）34,菌落或噬斑原位杂交筛选重组体,35,菌落或噬斑原位杂交筛选重组体35,重组,DNA,技术操作过程可形象归纳为：,分,分离获取目的基因,选,载体的选择与构建,接,目的,DNA,与载体连接,转,重组,DNA,转入受体细胞,筛,重组体的筛选与鉴定,36,重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 分分离获取目的基因 选,重组,DNA,技术操作的主要步骤,载体,质粒,噬菌体,病毒,目的基因（外源基因）,基因组,DNA,cDNA,人工合成,PCR,产物,限制酶消化,开环载体,DNA,目的基因,连接酶,重组体,转化,体外包装，转染,带重组体的宿主,筛选,表型筛选,酶切电泳鉴定,菌落原位杂交,37,重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源,38,1.,原核表达体系,(E.coli,表达体系最为常用,),2.,真核表达体系,(,酵母、昆虫、乳类动物细胞,),（六）克隆基因的表达,381. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用)（六,第三节,重组,DNA,技术在医学中的应用,第三节,利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为,21,世纪的支柱产业。,美国,Eli Lilly,公司于,1982,年首先利用重组,DNA,技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有,50,多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。,40,一、重组,DNA,技术广泛应用于生物制药,利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一,重组,DNA,医药产品,产 品,功 能,组织胞浆素原激活剂,抗凝,血液因子,VIII,促进凝血,颗粒细胞,-,巨噬细胞集落剌激因子,剌激白细胞生成,促红细胞生成素,剌激白细胞生成,生长因子,(bFGF, EGF),刺激细胞生长与分化,生长素,治疗侏儒症,胰岛素,治疗糖尿病,干扰素,(,1b,2a,2b,),抗病毒感染及某些肿瘤,白细胞介素,激活、剌激各类白细胞,超氧化物歧化酶,抗组织损伤,单克隆抗体,利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗,乙肝疫苗,(CHO,酵母,),预防乙肝,口服重组,B,亚单位菌体霍乱菌苗,预防霍乱,41,重组DNA医药产品产 品功 能组织胞浆素原激活剂,疾病相关基因的发现与鉴定,转基因和基因打靶,加速了人类基因组计划的完成,疾病的基因诊断和基因治疗,42,二、重组,DNA,技术还应用于医学的其他诸多方面,疾病相关基因的发现与鉴定42二、重组DNA技术还应用于医,