,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2019/12/6,#,2024/11/19,1,（一）原理,：,建立在,DNA,复制原理基础上的一种技术。,2024/11/19,2,2024/11/19,3,（二）典型的,PCR,包括许多循环，每个循环包括三个步骤：,（,1,）,高温,变性模板使之成为单链，,95,度约,1min,；,（,2,）,低温,使引物与单链模板退火（复性）,55,度左右；,（,3,）,中温,使引物沿模板延伸，,75,度左右。,经,n,次（,25-30,次）循环后，反应混合物中所含目的,DNA,片段（双链）的拷贝数理论上最高值为,2,n,。但是，在,第三轮,循环后，才会出现目的,DNA,片段。,2024/11/19,4,2024/11/19,5,思 考 题,扩增片断的长度的是如何决定的？,若以,N,表示扩增循环数，当一条双链模板循环扩增,30,次时，反应体系中总分子数多少？非目的产物多少？目的产物多少？,若用一条引物能否实现大量扩增？,2024/11/19,6,（三）,PCR,反应体系：,反应缓冲液,（,10PCR Buffer,）,脱氧核苷三磷酸底物,（,dNTPmix,）,耐热,DNA,聚合酶,（,Taq,酶，可耐受,95,度左右高温）,寡聚核苷酸引物,（,Primer1,，,Primer2,，约,20,个核苷酸，与目的,DNA,两侧的区域互补）,靶序列,（,DNA,模板）五部分组成。,2024/11/19,7,2024/11/19,8,1.,耐热,DNA,聚合酶,Taq,DNA,聚合酶的特点,Taq,DNA,聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌,YT-1,中分离纯化而得。,1),具有,5-3,聚合酶活性和,5,3,核酸外切酶活性,2),最适反应温度为,80,3),最适,pH8.0,和最佳反缓冲液,TrisHCl,4),最佳二价阳离子,Mg,2+,，其浓度取决于,dNTP,浓度（,2 mM,）,5),具良好的热稳定性：在,90,下连续反应,30,分钟仍有约,50%,的酶活,核苷酸错误掺入的几率比较高,2024/11/19,9,Taq DNA,聚合酶的特性,2024/11/19,10,Tth,DNA,聚合酶的特点：,从喜温性真菌中分离获得,1),具有强的,5-3,聚合酶活性，缺,3-5,核酸外切酶活性。,2),反应,pH,值为,9,，最适温度为,75,度。,3),在,Mn,2+,存在时，具有很强的反转录酶活性。,4),当系统同时存在,Mg,2+,时，反转录产生的,cDNA,在这种酶的作用下还可以进行,PCR,扩增。,故可用于,RT-PCR,。,2024/11/19,11,Pwo,DNA,聚合酶,从喜温性古细菌中发现，现在市场销售的,Pwo,DNA,聚合酶是在,E.coli,中表达后提取的产物。,1),具有强的,5-3,聚合酶活性，兼有,3-5,外切酶活性。,2),具有高的耐热性，,100,度下,2,小时后仍有一半的活性。,3),可扩增,5kb,的片段，扩增,DNA,的准确度比,Taq,DNA,聚合酶高约,10,倍。,4),且其扩增产物为平末端，可直接用于平末端连接。,C.therm.,聚合酶,1),是一种以,Mg,2+,为辅助因子的逆转录酶，最适温度在,60-70,度之间。在,RT-PCR,系统中催化逆转录反应。,2),具有,3-5,外切酶活性，合成,cDNA,准确度比,Tth,DNA,聚合酶高约,2,倍。,2024/11/19,12,2.,模板：,PCR,扩增的模板通常是从细胞中提取出来的总,DNA,，也可以是,mRNA,反转录后形成的,cDNA,。,DNA,是一种非常稳定的分子，其作为模板影响,PCR,效果的因素有：,1.,模板的纯度；,2.,模板,DNA,的量；,2024/11/19,13,3. PCR,引物：,PCR,引物是与模板,DNA,互补的两条人工合成的寡核苷酸链，通常由,15-30,个核苷酸构成。引物与单链,DNA,模板的,3,端互补且具有游离的,3,羟基。引物互补于所需扩增,DNA,片段的两端，使,DNA,片段的扩增只限于引物之间的区段。,3,5,5,3,-OH,HO-,2024/11/19,14,引物的设计：,1.,引物长度,：一般,20bp,左右。,2.,引物的碱基组成,：一般,G+C,占,50-60%,，尽量避免数个连续排列的嘌呤或嘧啶。一对引物之间不能有,2,个以上的碱基互补，特别是,3,端；引物本身避免有回文序列。,3.,酶切位点的设计,：,PCR,扩增中，对引物,5,端碱基的要求较低，可在引物的,5,端加上特殊序列，如限制性酶切位点。,4.,复性的温度,：引物与模板复性温度和所需时间取决于引物的碱基组成、长度、溶液中引物的浓度。复性温度一般低于引物本身的实际变性温度（,Tm,）,5,度。,Tm=,（,G+C,）,X4,（,A+T,）,X2,。复性温度通常在,55-72,度之间，提高复性温度可提高引物与模板结合的特异性。,2024/11/19,15,4. dNTPs,：,是,dATP,、,dCTP,、,dGTP,、,dTTP,的总称，储存液,pH7.0,，浓度一般为,2mM,，分装后,20,度冻存。典型的,PCR,扩增体系中，,dNTPs,的终浓度为,20-200uM,。,5. Mg,2+,浓度：,Mg,2+,浓度太低会无,PCR,产物，太高会导致非特异产物的合成。通常情况下，反应体系中有,0.5-2.5mM,游离,Mg,2+,。,6. PCR,系统中的其他成分：,PCR,反应缓冲液通常用,10mMTris-HCl(pH8.3),；,50mMKCl,；明胶或血清白蛋白（,100ug/ml,）及非离子去污剂等。,2024/11/19,16,PCR,仪,2024/11/19,17,（四）,PCR,反应技术类型,1.,巢式,PCR,（,nested PCR,）：,设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产物为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵敏度，比单一的一对引物,PCR,扩增灵敏度特异性增加,1000,倍。,2024/11/19,18,2024/11/19,19,2.,不对称,PCR,（,asymmetric PCR,）：,多用于序列分析。扩增时两引物按,50:1,比例加入反应体系。最终扩增产物大部分是单链,DNA,，可用于对靶序列进行测序。,2024/11/19,20,2024/11/19,21,3.,反转录,PCR,：,是一种从,RNA,扩增,cDNA,拷贝的方法。,2024/11/19,22,4.,定量,PCR,（,quantitative PCR,，,Q-PCR,）：,是应用一种,标准作对照,，估计出一种特异性靶,DNA,或,RNA,分子相对含量的技术。,2024/11/19,23,介绍：基于,PCR,的分子标记技术,2024/11/19,24,遗传标记,遗传标记（,Genetic marker,）,指可识别的等位基因。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。,类型：,形态标记（,morphological marker,）,细胞学标记,(cytological marker),生化标记,(biochemical marker),分子标记,(molecular marker),2024/11/19,25,在遗传育种研究中可被利用的遗传标记应具备以下几个条件：,（,1,）多态性高；,（,2,）表现共显性；,（,3,）对农艺性状影响小；,（,4,）经济方便，容易观察记载。,2024/11/19,26,一、形态标记,即外部形态特征。主要包括肉眼可见的外部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。,形态标记简单直观、经济方便；但数量在多数生物中有限，且多态性较差，表现易受环境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。此外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。因此形态标记在遗传育种中的作用是有限的。,2024/11/19,27,二、细胞学标记,即细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（,C,带、,N,带、,G,带等）的变化。,与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。因此到目前为止，真正应用于遗传育种研究中的细胞学标记还很少。,2024/11/19,28,三、生化标记,主要包括,同工酶和等位酶标记,。,同工酶：,指结构不同、功能相似的酶，也即具有同一底物专一性的不同分子形式的酶。属于一个以上基因座位编码的酶的不同形式；,等位酶：,是指由一个基因座的不同等位基因编码的酶的不同分子形式；,分析方法：,从组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。,2024/11/19,29,与形态标记、细胞学标记相比，生化标记具,两个方面的优点：,一是表现近中性，,对植物经济性状一般没有大的不良影响；,二是直接反映了基因产物差异，,受环境影响较小。但目前可使用的生化标记数量还相当有限，且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度，因此其实际应用受到一定限制。,2024/11/19,30,四、分子标记（,DNA,标记）,在遗传学研究中广泛应用的,DNA,分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为两大类：,2024/11/19,31,（,1,）以,Southern,杂交技术为核心的分子标记，（如,RFLP,），这类分子标记被称为第一代分子标记。,（,2,）是以,PCR,技术为核心的分子标记，（如,STS,、,RAPD,、,AFLP,、,SSR,）等，这类分子标记被称为第二代分子标记；,（,3,）单核苷酸多态性（,SNP,）标记被称为第三代分子标记 。它也是以,PCR,技术为基础的分子标记技术。,2024/11/19,32,英文缩写,英文名称,中文名称,RFLP,Restriction fragment length,polymorphism,限制性片段长度多态性,STS,Sequence tagged site,序列标签位点,RAPD,Random amplified polymor-,Phic DNA,随机扩增多态性,DNA,AFLP,Amplified fragment length,Polymorphism,扩增片断长度多态性,SSR,Simple sequence repeat,简单序列重复,SNP,Single,nucleotide polymor-,phism,单核苷酸多态性,几种主要的分子标记,2024/11/19,33,几种主要的分子标记,（一）,RFLP,标记：称为限制性片段长度多态性，是指用某一种限制性内切酶来切割来自不同个体的,DNA,分子上，内切酶的识别序列有差异，即是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。这种差异反映在酶切片段的长度和数目上。,2024/11/19,34,RFLP,标记是发展最早的,DNA,标记技术。,RFLP,技术主要包括以下基本步骤：,DNA,提取用限制性内切酶酶切,DNA,、 用凝胶电泳分开,DNA,片段把,DNA,片段转移到滤膜上利用放射性标记的探针杂交显示特定的,DNA,片段（,Southern,杂交）和结果分析。,2024/11/19,35,2024/11/19,36,2024/11/19,37,特点,A,无表型效应，,RFLP,标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响。,B RFLP,标记在等位基因之间是共显性的，因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。,C,在非等位的,RFLP,标记之间不存在上位效应，因而互不干扰,2024/11/19,38,D RFLP,标记起源于基因组,DNA,的自身变异，在数量上几乎不受限制,E DNA,需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。在植物分子标记辅助育种中需要将,RFLP,转换成以,PCR,为基础的标记。,2024/11/19,39,（二）,AFLP,标记,AFLP,标记是扩增片段长度多态性的简称,是,RFLP,与,PCR,两项技术相结合的产物，,AFLP,技术的主要步骤：,DNA,提取两种限制性内切酶酶切,DNA,寡聚核苷酸接头的连接对限制性酶切片段的选择性扩增扩增产物的电泳分析。,由于不同材料,DNA,酶切片段存在差异，因而便产生发扩增产物的多态性。,2024/11/19,40,AFLP,标记的主要特点有：,（,1,）由于,AFLP,分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；,（,2,）典型的,AFLP,分析，每次反应产物的谱带在,50-100,条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；,（,3,）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；,（,4,）分辩率高，结果可靠；,（,5,）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。但也存在假阳性带出现频繁、技术复杂、成本高等缺点。,2024/11/19,41,（三）,RAPD,标记,RAPD,标记的基本原理是利用合成的随机引物（一般为,810,个碱基）对基困组,DNA,进行,PCR,扩增 ，然后电泳检测,PCR,产物的多态性。,2024/11/19,42,RAPD,标记的主要特点有：,（,1,）不需,DNA,探针，设计引物也无须知道序 列信息；,（,2,）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；,（,3,）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；,（,4,）,DNA,样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；,（,5,）实验重复性较差，结果可靠性较低。,2024/11/19,43,（四）,SSR,标记,又叫微卫星,DNA,标记，它是指基因组中存在的由,2-5,个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，广泛分布于真核生物基因组中。,SSR,标记具有共显性、高多态性和易于检测等优点，是一种理想的分子标记，,2024/11/19,44,SSR,标记的主要特点有：,（,1,）数量丰富，广泛分布于整个基因,（,2,）具有较多的等位性变异；,（,3,）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；,（,4,）实验重复性好，结果可靠；,（,5,）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。,2024/11/19,45,（五）,SNP,标记,也是以,PCR,技术为基础的分子标记技术。它是指不同生物个体基因组,DNA,序列之间单个核苷酸的差异，这种差异可以通过设计特异,PCR,引物扩增和电泳检测显示出来。,SNP,标记是根据基因组测序结果发展起来的，数量非常丰富。检测,SNP,的最佳方法是新近发展起来的,DNA,芯片技术。,目前,SNP,作为一种的分子标记技术，已有,2000,多个,SNP,标记定位在人类染钯体上，在稻和大豆等植 物上也发展了一些,SNP,标记。,2024/11/19,46,DNA,分子标记在生物技术中的应用,D,NA,分子标记是现代生物技术中应用的重要工具，其应用主要包括以下几个方面：,构建高密度的遗传连锁图 ：在经典遗传学中由于遗传标记的数量较少，只能建立稀疏且分布不均匀的遗传连锁图。,DNA,分子标记数量丰富，为高密度遗传图谱的制作提供了可能，促进,DNA,指纹的分析。,进行基本定位：基本定位就是寻找与目的的基因紧密连锁的遗传标记并确定其在染色体上的位置，高密度遗传连锁图的建立使目的基因的定位更为方便。,2024/11/19,47,遗传多样性和物种亲缘关系：分子图谱的构建和基因定位更加有利于遗传多样性和物种亲缘关系的研究。遗传多样性是品种遗传改良的基础。,种质鉴定和遗传背景分析：利用,DNA,分子标记可以鉴别品种，评估品种纯度，分析农艺形状基因，分离和鉴别遗传材料，确定染色体同源性，对异源染色体和染色体结构畸变的检测。,育种中的分子标记辅助选择：长期以来，育种都是依植株的表型性状进行选择的。,DNA,标记的出现使育种从表型选择过渡到分子育种的新阶段。,2024/11/19,48,二、,DNA,测序技术,DNA,序列分析方法主要有两种：,1. F. Sanger,和,A. R. Coulson,发明的,链末端测序法,；,2. A. Maxam,和,W. Gilbert,发明的,化学消化法,。,链末端测序法：,一个测序反应一般可获得,400-750,个核苷酸,序列。,2024/11/19,49,（一）末端测序法：,利用,DNA,复制原理的一种测序方法，只适用于单链,DNA,的测序，测序前要将待测,DNA,分子（单链）克隆到,M13,载体中。,2024/11/19,50,1.,引物和,DNA,聚合酶：,引物与,M13,载体上的,DNA,序列互补结合。,DNA,的聚合需要,Klenow,片段或其他测序酶。,2.,互补链的合成：,在反应体系中加入,dNTPs,，此外，还需加入一种被修饰的单核苷酸，即,双脱氧核苷酸（,ddNTPs,）,。它能加入到正在延长的核苷酸链中，但会导致链的合成终止。设置四个平行实验，分别在每个体系中加入四种,ddNTP,（放射性标记），这样，每个体系的产物其末端均为同一种,ddNTP,形成四组独立的末端核苷酸不同的,链簇,。,3.,电泳分离产物并读取,DNA,顺序：,凝胶电泳分离合成产物。通常在聚丙烯酰胺凝胶上进行（厚度,0.5mm,），加入尿素使新合成,DNA,链与模板链分离，同时低电压下电泳使凝胶温度缓慢加热到,60,度，避免链的再度结合。放射自显影观察实验结果，,读取,DNA,顺序,。,2024/11/19,51,dATP,与,ddATP,2024/11/19,52,2024/11/19,53,2024/11/19,54,2024/11/19,55,（二）,Maxam-Gilbert,法：,DNA,的化学消化法,用一种专一降解某一个核苷的化学试剂使,DNA,链断开。,2024/11/19,56,2024/11/19,57,（三）,PCR,产物测序：,1.,直接测,PCR,产物序列的方法：,由,Sanger-Coulson,测序法衍变而来。从,PCR,产物中分离提纯出单链，然后直接以此单链,DNA,分子为模板，按照,Sanger-Coulson,测序法进行测序，,所需引物必须与纯化的单链,DNA,互补。,2024/11/19,58,2.,热循环测序：,将,PCR,反应和测序反应合成一个反应,来对,PCR,产物进行测序，这样就,没有必要提纯出单链,DNA,，这种技术叫热循环测序。,其反应体系与,PCR,体系有两点不同：,首先，热循环测序过程中只需要加入一个引物。,其次，热循环体系是在每次实验时都只有一种,ddNTPs,的四组平行实验。,2024/11/19,59,（四）全自动,DNA,测序法：,自动测序仪。将四种,ddNTPs,分别用四种不同的荧光标记物进行标记，将,Sanger-Coulson,的四个反应放在一个试管中进行，然后将产物通过,PAGE,或毛细管电泳进行分离。检测器检测出每条带发出的荧光强度并将数据输入电脑，从而得到,DNA,碱基的正确顺序。,2024/11/19,60,2024/11/19,61,全自动,DNA,测序仪,2024/11/19,62,（五）大分子,DNA,的测序：,利用片段重叠法获得大分子的序列。,