单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验 双缩脲法测定蛋白质浓度,一、实验目的,1.学习分光光度法测定的原理和方法,2.学习蛋白质含量测定的原理和方法,3.,掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法,二、原理,一、分光光度法的基本原理及方法,（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析,1原理,2主要方法：,（1）比较吸收光谱曲线,（2）比较最大吸收波长,蛋白质的最大吸收波长为280nm，,核酸的最大吸收波长为260nm。,（3）比较吸光度的比值,纯DNA,（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析,1原理,Beer-Lambert（比尔）定律：,T=I/I,0,A=lg1/T=lgI,0,/I,A=KCL,其中：T为透光率；A为吸光率；I,0,为入射光强度；I为透射光强度；,K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度,2常用方法,（1）标准曲线法,标准曲线与样品的测定条件必须一致。,（2）标准管法,C,X,/A,X,=C,S,/A,S,，已知C,S,，测定A,S,、A,X,，可求得C,X,。,（3）摩尔吸光系数法,C=A/,（,为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。,四、分光光度计的使用,1722型分光光度计的外形,2.仪器操作键介绍,“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式,“100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度),“0%T”键：用于自动调整零透射比,“波长设置”旋钮：用于设置分析波长,3.样品测试操作,打开电源开关，使仪器预热20分钟,用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上,打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路,盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零,取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比,按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A),将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中,打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖,将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A,将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数,实验完成后，关闭电源，,洗净比色皿,，并盖好盖布。,返回,光路,返回,光路,返回,微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量,被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。,因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。,Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度,蛋白质含有两个以上的肽键(CONH)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu,2+,形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸磷钨酸试剂)，蛋白质铜络合物能还原磷钼酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。,紫外分光光度法测定蛋白质浓度,由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD,280,)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。,利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。,总蛋白定量分析BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）,准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是202000g/ml；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20g/ml,快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便,经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量,不受样品中离子型和非离子型去污剂影响,检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝,基本原理：,碱性条件下，蛋白将Cu,2+,还原为Cu,+,，Cu,+,与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。,考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度,考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。,Coomassie Dye-Based 蛋白质定量,PROTEIN,+,A,max,=595nm,BLUE,Acid,Coomassie G-250,Protein-Dye,Complex,O,CH,2,CH,3,NH,C,CH,3,CH,3,N,CH,2,SO,3,-,CH,3,CH,2,N,CH,2,CH,2,CH,3,SO,3,Na,+,（二）,双缩脲法测定蛋白质,H,2,N-CO-NH,2,+NH,2,-CO-NH,2,H,2,N-CO-NH-CO-NH,2,NH,3,双缩脲,双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。,本法测定蛋白质范围1-10mg,三、操作步骤,1.取15支试管，按下表编号、加试剂,管号,0,1,2,3,4,5,6,样品,牛血清白蛋白(mg),0,0.6,1.2,2.4,3.6,4.8,6.0,2mg/mL,牛血清白蛋白体积,(mL),0,0.3,0.6,1.2,1.8,2.4,3.0,待测液体积(mL),3.0*,蒸馏水(mL),3.0,2.7,2.4,1.8,1.2,0.6,0,0,OD540,2.各管,混匀,后，加入双缩脲试剂3.0mL,37,o,C反应30min。,3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。,四、结果处理,1.绘制标准曲线,以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD,540,为纵坐标，绘制标准曲线。,2.样品的计算,根据样品的OD,540,从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。,五、注意事项,1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。,2.*样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。,3.比色杯的使用,