单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,基因工程抗体,基因工程抗体,1,Emil von Behring,1901,antitoxins,Georeges Kohler and Cesar Milstein,1984,monoclonal antibody,Susumu Tonegama,1987,structure of Ig gene,Gerald Edelman and Rodney Porter,1972,structure of antibody,Paul Ehrlich ,1908,production of antibody,Nobel Prize winners,Emil von Behring, 1901, antito,2,基因工程抗体ppt课件,3,免疫球蛋白的功能,免疫球蛋白的功能,4,5,美国,FDA,已批准的治疗抗体药物,Orthoclone,ReoPro,Rituxan,Zenapax,Simulect,Synagis,Remicade,Herceptin,Mylotarg,Campath-1H,Zevalin,移植排斥,心绞痛,B,细胞非霍奇金淋巴瘤,移植排斥,移植排斥,婴儿呼吸道合胞病毒,类风湿关节炎,乳腺癌,急性复发性髓性白血病,难治性慢性淋巴细胞白血病,难治性,B,细胞非霍奇金淋巴瘤,1986,1994,1997,1997,1998,1998,1998,1998,2000,2001,2002,5美国FDA已批准的治疗抗体药物Orthoclone移植排斥,一,抗体,分子结构,一 抗体分子结构,6,免疫球蛋白的功能区,免疫球蛋白的功能区,7,免疫球蛋白的水解片段,免疫球蛋白的水解片段,8,complimentarity determining region,CDR,complimentarity determining re,9,hypervarible region,(HVR),(,complimentarity determining region,CDR,) :,formation of the Ag binding site,基因工程抗体ppt课件,10,purple : HV CDR,( in both the ribbon and ball and stick views),green : antigen,HV sequences contact the antigen.,antibody,antigen,antigen-antibody complex:,epitope,purple : HV CDR antibodyantig,11,the antibody molecular surface, with the PorA antigen superimposed.,Closeup of a hydrogen bond The Tyr 101 of the antibody forms a hydrogen bond with the Gln 121 of the antigen,the antibody molecular surface,12,13,Ig,胚系基因结构特点,在,Ig,分子多肽链中，,型、,型轻链和,Ig,的重链分别写作,Ig,、,Ig,和,IgH,，基因依次写作,IGK,、,IGL,和,IGH,，其分别位于第,2,、,22,和,14,号染色体上。,13Ig胚系基因结构特点在Ig分子多肽链中，型、型轻链和,14,重链,:,位于,14,号染色体，可分为,4,组,C,V,区编码基因,:,V,H,(,可变区,) - 48 D,H,(,多样性区,) - 23 J,H,(,连接区,) - 6,C,区编码基因,:,C,H,(,恒定区,): C, C, C,等,10,个片段,14重链: 位于14号染色体，可分为4组CV区编码基因:,15,轻链,(,-2,号染色体, -22,染色体,),V,区编码基因,:, - V, J - 40, 5 - V, J - 30, 4,C,区编码基因,:,C (1); C(4),15轻链(-2号染色体, -22染色体)V区编码基因,二、细胞工程抗体和基因工程抗体,第一代：多克隆抗血清,第二代：细胞工程抗体,第三代：基因工程抗体,抗体技术的发展经历了三个阶段,二、细胞工程抗体和基因工程抗体第一代：多克隆抗血清抗体技术的,16,1890,年,Behring,和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。,1937,年,Tiselius,等人用电泳法将血清分为白蛋白、甲种（,）球蛋白、乙种（,）球蛋白、丙种（,）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。,1975,年,K,hler and Milstein,等首次利用,B,淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体,(monoclonal antibody, MAb),。,1994,年基因工程抗体,。,1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素，并建,17,1、,多克隆抗体,(polyclonal antibody; PcAb),1、多克隆抗体(polyclonal antibody;,18,多价抗原,多个,克隆,（致敏的,B,细胞）,多,克隆抗体,多价抗原多个克隆多克隆抗体,19,实际意义,（,1,）预防、治疗感染性疾病，,如：破伤风抗毒素血清, 抗,破伤风，,胎盘球蛋白, 抗病毒感染,等，,副作用：,超敏反应。,（,2,）临床诊断，,如：肥达氏反应,-,伤寒、副伤寒，,缺点：特异性差。,实际意义,20,2、,单克隆抗体（,monoclonal antibody, McAb,）,由单一克隆,B,细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。,特点：具有高度均一性。,杂交瘤细胞：,骨髓瘤细胞,-,无限增殖；,免疫,B,细胞,-,合成、分泌特异性抗体。,杂交瘤技术,- HAT,培养基：次黄嘌呤,(H),氨基蝶呤,(A),和胸腺嘧啶核苷,(T),。,2、单克隆抗体（monoclonal antibody, M,21,单抗制备的流程图,单抗制备的流程图,22,实际意义：,（,1,）抗原的纯化和结构分析；,（,2,）细胞发生、分化及功能的阐明；,（,3,）临床疾病的诊断和治疗，,如：免疫分子检测；,免疫导向药物治疗恶性肿瘤,- McAb,抗癌药物,(,毒素或,放射核素偶联,),。,23,多克隆抗体,单克隆抗体,来源,动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群,多为鼠源性,特点,来源广泛、制备容易,纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应,组成,针对不同抗原表位的抗体的混合物,针对单一表位，结构和组成高度均一，抗原特异性及同种型一致,应用,疾病的被动免疫治疗,疾病诊断、特异性抗原或蛋白的检测和鉴定、疾病的被动免疫治疗和生物导向药物制备,缺点,特异性不高、易发生交叉反应，不易大量制备,人体应用后可导致人鼠抗体反应,多克隆抗体与单克隆抗体的比较,多克隆抗体单克隆抗体来源动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接,24,单抗体内应用和疗效受限原因,：,1.,鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性,2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少,3.生产成本高,难于普及应用,单抗体内应用和疗效受限原因：,25,人,杂交瘤技术未获真正突破,原因,:,融合,率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫,新,思路,：尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。,基因工程,抗体,：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体，主要,包括,嵌合抗体,、人源化抗体、小分子抗体、抗体融合蛋白和双特异性抗体,。,人杂交瘤技术未获真正突破原因:融合率低、建株难、不稳定、产量,26,27,基因工程抗体,27基因工程抗体,1,小分子抗体,3,鼠单抗人源化,基因工程改造的抗体,2,1 小分子抗体3 鼠单抗人源化基因工程改造的抗体2,28,第一代的抗体人源化,嵌合抗体,从杂交瘤细胞分离出,鼠,MAb,功能性可变区基因，与人,Ig,恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人,-,鼠嵌合抗体。,嵌合抗体由于这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好，但因鼠单抗可变区的存在，应用时仍有较强的免疫排斥反应。,特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。,第一代的抗体人源化嵌合抗体 特点：减少了鼠源性抗体,29,Pr,鼠,VH,人,CH Pr,鼠,VL,人,CL,免疫球蛋白,基因载体的构建,H,链嵌合载体,L,链嵌合载体,共转染细胞,启动子,人,-,鼠嵌合抗体基因工程改造策略,Pr 鼠VH 人 CH,30,鼠,VH,鼠,V L,人,CL,人,CH,抗体分泌细胞,人,-,鼠嵌合基因工程抗体,鼠VH鼠V L人CL人CH抗体分泌细胞人-鼠嵌合基因工程抗体,31,第二代的抗体人源化,改型抗体,在嵌合抗体的基础上进一步将鼠,MAb,可变区中相对保守的,FR(framework region),替换成人的,FR,，保留与抗原结合部位,决定簇互补区,（,complement determinant region),部位,(,即,CDR,移植,),早期的改型抗体：,简单的,CDR,移植，通过点突变进行微调即更换某个位点上的氨基酸。,第二代的抗体人源化改型抗体 在嵌合抗体的基础,32,基因工程抗体ppt课件,33,CDR,序列,CDR,序列,鼠单克隆抗体,人抗体,人源化抗体,鼠单克隆,V,区人源化（,CDR,移植）,CDR序列 CDR序列 鼠单克隆抗体 人抗体人源化抗体鼠单克,34,小分子抗体,人源化抗体属完全的抗体分子。通过基因重组技术，可以在保持原有抗原结合活性的基础上，把完整的抗体分子改造成较小的分子，称为小分子抗体。,根据其价数的不同可分为单价小分子抗体及多价小分子,抗体。,小分子抗体,35,单价小分子,抗体,一,、,Fab,抗体,Fab,段由重链,V,区及,CH1,功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。,Fab,抗体只有完整,IgG,的,1/3,。,单价小分子抗体,36,二、单链抗体,(ScFv),定义：用基因工程方法，,将抗体,VH,和,VL,（重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成的小分子抗体，,功能：具有较好的抗原结合能力，且分子量小、穿透力强、免疫原性低等特性。可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件 。,Ag,二、单链抗体(ScFv)Ag,37,ScFv,应用,：,用于肿瘤的导向治疗,肿瘤的影像分布,基因治疗,研究基因结构与功能的关系,ScFv应用：,38,小,分子抗体,1,2,3,小分子抗体123,39,免疫球蛋白,基因载体的构建,H,链表达载体,L,链表达载体,共转染细胞,Pr VH CH1 Pr VL CL,Fab,抗体分子的制备,I Fab antibody molecule,免疫球蛋白H链表达载体L链表达载体共转染细胞Pr,40,抗体分泌细胞,VH,VL,CL,-S-S-,CH1,Fab,抗体分子的制备,抗体分泌细胞VHVLCL-S-S-CH1Fab 抗体分子的制,41,II Fv antibody molecule,II Fv antibody molecule,42,分别构建载体,L,链表达载体,H,链表达载体,共转染细胞,Pr VH Pr VL,Fv ,二硫键稳定的,Fv (disulfide-stabilized Fv,ds-Fv),小分子抗体的制备,(1) ds-Fv,分别构建载体L链表达载体H链表达载体共转染细胞Pr,43,抗体分泌细胞,VH,VL,-S-S-,Fv,小分子抗体的制备,disulfide-stabilized Fv,ds-Fv,抗体分泌细胞VHVL-S-S-Fv小分子抗体的制备disul,44,VH VL,接头,DNA (Gly4Ser)3,VH,引物,PCR,VH,接头,DNA,酶切、克隆,ScFv (single chain Fv,scFv ),的构建,变性、复性,VL,引物,(2) Sc-Fv,VL,VH,45,三、单域抗体,抗体,与抗原的结合主要由,Ig,的,V,区决定，因此只含,V,区基因片段的小分子抗体，即只有,VH,或,VL,一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个,Ig,分子的,1,12,，故也称之为小抗体。,三、单域抗体,46,四,.,超变区,多肽,抗体抗原结合是经过补体决定区（,CDR,）来实现。因此，,CDR,是构成抗原抗体结合的最小结构单位。根据这一特点，可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的,CDR,多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种只含有一个,CDR,多肽的抗体，称为超变区多肽，亦称为最小识别单位,(minimal recognition unit, MRU),。,四.超变区多肽,47,提高抗体,效应功能,抗体融合蛋白,双特异性抗体,偶连细胞毒物质,细胞内抗体,提高抗体效应功能,提高抗体抗体融合蛋白双特异性抗体偶连细胞毒物质细胞内抗体提高,48,双特异性抗体,抗原,A,抗原,B,-S-S-,Fab,VH,CH1,VL,-S-S-,CH1,VH,VL,Fv,VH,VL,双特异性抗体 抗原A抗原B-S-S-FabVHCH1VL-S,49,基因工程抗体ppt课件,50,CTL,CD3,TUMOR,CELL,-S-S-,VH,CH1,VL,-S-S-,CH1,抗原,A,抗原,B,CTLCD3TUMOR-S-S-VHCH1VL-S-S-CH,51,制备双特异性抗体的方法,主要有,3,种：,（,1,）杂化杂交瘤技术：将具有某种特异性（如抗瘤细胞）的,Mab,细胞株与具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）的小鼠脾细胞进行融合，即产生出杂化杂交瘤细胞株的二价瘤体。,制备双特异性抗体的方法主要有3种： （1）杂化杂交瘤技术：将,52,它们分泌的是重链、轻链被杂化的抗体分子，有,10,种形式：,重链、轻链都无改变，保持原特异性的配对抗体分子：,LH-HL,，,KG-GK,重链特异性相同的配对抗体分子：,LH-HK,，,KH-HK,KG-GL,，,LG-GL,重链、轻链特异性不同的配对抗体分子：,LH-GK,，,LH-GL,KH-GL,，,KH-GK,它们分泌的是重链、轻链被杂化的抗体分子，有10种形式：,53,在这些杂化抗体分子中，只有,LH-GK,配对的才是所需的双功能抗体分子。,在这些杂化抗体分子中，只有LH-GK配对的才是所需的双功能抗,54,（,2,）化学交联法：,Nisonoff,和,Rivers,最早从事这方面的研究。化学交联的方法无需经过细胞融合，所以比较简便易行。,通常利用重链与轻链这间的二硫链经还原和再氧化，将两种不同特异性抗体的半分子结合在一起。或用双功能交联剂，如邻苯酸酯等，把两个抗体半分子交联在一起。,（2）化学交联法：Nisonoff和Rivers最早从事这方,55,基因工程抗体ppt课件,56,用于制备双功能抗体的,Mab,可以是完整分子，也可是经胃酶水解获得,F,（,ab,）,2,片段。后者在减少鼠源免疫原性方面，效果较好。,用于制备双功能抗体的Mab可以是完整分子，也可是经,57,（,3,）利用基因工程技术将两套重轻链基因导入骨髓瘤细胞或传染瘤细胞中。,这种方法制备的双功能抗体可选择合适的稳定区和合适的类及亚类，而得到较好的产量较高的双功能抗体。由于只有较少的嵌合导入并整合到宿主基因组，故传染瘤细胞更为稳定，染色体不易丢失,（3）利用基因工程技术将两套重轻链基因导入骨髓瘤细胞或传染瘤,58,抗体融合蛋白,：抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的具有新的特性融合蛋白。,根据构建方式的不同，主要分为两种形式：,Fc,融合蛋白,（,Fc fusion protein,FcFP,）由抗体的,Fc,段与某些具有特定功能的蛋白结构域融合而成。如,CD4,免疫粘附素，就是由抗体的,Fc,段与,2,个,CD4,分子的,Ig,同源区重组而成,抗原结合融合蛋白,（,antigen-Binding fusion protein, ABFP,）由具有抗原结合功能的抗体结构与其他功能性蛋白融合构成。如免疫毒素，抗体部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。,抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的具有新,59,免疫粘附素,(immunoadhension),：,将人抗体恒定区,(,主要是,Fc,段,)N-,端连接于人细胞表面的受体分子或细胞粘附分子上，在真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体蛋白分子，这种分子可同时发挥抗体的效应功能及其它相应的效应功能，这种分子又被称为新效能抗体。,免疫毒素：,又称生物导弹，是由导向性的载体分子与具有毒性的弹头蛋白交联而制成，属于导向药物的一种。,免疫粘附素(immunoadhension),60,免疫毒素,C,C,V,C,V,C,C,C,SPDP,SPDP,Ricin A,Ricin A,（,-FcRI-Ricin A,）,Ricin A:,蓖麻毒素,A,对肿瘤细胞具有毒性作用,免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicin ARic,61,偶连细胞毒物质,连接放射性同位素,(,131,I,、,99m,Tc,）,连接植物或细菌毒素（,ricin,、,PE,40,）,连接细胞毒性药物（,C1027,、,柔红霉素）,偶连细胞毒物质连接放射性同位素(131I、99mTc）,62,CH1,CH2,CH3,IL-2,scFv,IL-2,免疫细胞因子,(Immunocytokine),CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2 免疫细胞,63,复习题,简述真核表达载体的种类及特点。,哺乳动物的常用标记有哪些？其原理是什么？,哺乳动物表达载体有哪几类？各有何优缺点？,常用的核酸探针有哪几类？各有何特点？,核酸列举常用的探针标记物及标记方法。,简述核酸分子杂交的过程及种类。,简述人,-,鼠嵌合抗体基因工程改造策略,简述制备双特异性抗体的主要方法及其特点,复习题,64,