,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,第,3,节 薄层色谱分离检测技术,一、分离原理,薄层色谱是一种开放性色谱，是将混合组分样品溶液点在薄层板一端的起始线上，点样处称为原点，在密闭容器中用适宜的流动相（薄层色谱法中又称为展开剂）展开。因吸附剂对不同组分的吸附能力不同，展开剂对不同组分的解吸能力也不完全相同，造成各组分在薄层析上移动的速度有快有慢，经过一段时间展开后，不同的组分彼此分开，最终形成相互分离的斑点,薄层色谱法,(thin layer chromatography,，,TLC),将固定相均匀平铺在光洁表面的玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法,可分为,吸附,、分配、分子排阻色谱法等,第3节 薄层色谱分离检测技术 一、分离原理薄层色谱法(thi,1,二、薄层色谱参数,1,比移值,(1,）定义,组分迁移的距离与展开剂迁移的距离之比,(2),计算方法,二、薄层色谱参数1比移值(2)计算方法,2,2,相对比移值,(1,）定义,指被测组分的比移值与参照组分的比移值之比,(2,）计算方法,(3,）特点,消除系统误差，值的重复性和可靠性都比 好,2相对比移值(1）定义(2）计算方法(3）特点,3,3,分离度,（,1),定义,衡量薄层色谱分离效果的重要指标，是指相邻两斑点中心至原点的距离之差与两斑点平均径向宽度（,径向宽度是指斑点沿着展开方向的宽度,）的比值,(2,）计算方法,3分离度（1)定义(2）计算方法,4,三、仪器与材料,1,吸附剂,粒径,540,硅胶,聚酰胺,微晶纤维素,氧化铝,硅藻土,常用,硅胶,H,硅胶,G,硅胶,GF,254,硅胶,HF,254,想一想,H,、,G,、,F,各代表何种意思？试解释硅胶,HF,365,？,三、仪器与材料1吸附剂粒径 540 硅胶聚酰胺 微,5,2,载板,玻璃板,塑料膜,金属箔,厚度,2mm,规格,5cm20cm,10cm10cm,10cm15cm,10cm20cm,种类,要求,表面光滑、平整清洁,玻板处理措施,清洁剂或铬酸洗液浸泡洗涤，用清水充分清洗，再用蒸馏水或去离子水冲洗，表面应不附水珠，晾干备用,2载板玻璃板塑料膜金属箔厚度 2mm 规格5cm20,6,3,点样器,手动,全自动点样仪,定量毛细管,平口微量注射器,3点样器 手动全自动点样仪定量毛细管 平口微量注射器,7,3,展开容器,平底色谱专用展开缸,双槽薄层色谱专用展开缸,3展开容器 平底色谱专用展开缸双槽薄层色谱专用展开缸,8,4,显色剂,显色剂,适用范围,显色方法,斑点颜色,浓硫酸乙醇溶液,多数有机化合物,喷雾加热,多数加热后呈黑色,碘,多数有机化合物,薰蒸,多数显黄棕色,磷钼酸乙醇溶液,醛等还原性物质,喷雾烘干,蓝色,茚三酮试液,氨基酸类,喷雾或浸渍,紫色或黄色,三氯化铁,-,铁氰化钾试液,含酚羟基化合物,喷雾或浸渍,红褐色或棕红色,4显色剂显色剂适用范围显色方法斑点颜色浓硫酸乙醇溶液多数有,9,5,显色装置,喷雾瓶,浸渍槽,蒸气熏蒸,-,双槽展开缸,5显色装置 喷雾瓶浸渍槽蒸气熏蒸 -双槽展开缸,10,6,检视装置,紫外分析仪,(,三用,),摄像设备,薄层色谱扫描仪,(,CS9301,型）,6检视装置 紫外分析仪(三用)摄像设备薄层色谱扫描仪(CS,11,四、操作技术,1,薄层板制备,自制薄层板,市售薄层板,无黏合剂,分类,含黏合剂,10%,15%,煅石膏,0.2%,0.5%,羧甲基纤维素钠水溶液,操作方法,普通薄层板,(,玻璃、聚酰胺薄膜和铝基,),高效薄层板（,固定相粒径为,57,）,分类,操作方法,临用前一般应在,110,活化,30,分钟。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板和聚酰胺薄膜可根据需要剪裁,四、操作技术1薄层板制备自制薄层板 市售薄层板 无黏合剂分,12,操作方法,将1份固定相和3份水（或羧甲基纤维素钠水溶液）在研钵中沿同一方向研磨混匀，去除表面的气泡后，置玻璃板上使涂布均匀，或倒入涂布器（见图8-14）中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布(涂层厚度为0.2mm0.3 mm)，取涂好的薄层板，置水平台上于室温下晾干后，在110活化30分钟，立即置于有干燥剂的干燥器中备用。,手动涂布器,操作方法将1份固定相和3份水（或羧甲基纤维素钠水溶液）在研钵,13,2,点样,普通板,点样基线,-,距底边,2.0cm,圆点状,-,R,3mm,条带状,-,宽度,5,10mm,点或条带间距,-,8mm,点样量,-,10,高效板,点样基线,-,距底边,0.81cm,圆点状,-,R,2mm,条带状,-,宽度,4,8mm,点或条带间距,-,5mm,点样量,-,5,2点样 普通板高效板,14,3.,展开,（,1,）展开要求,查阅,A.,何为边缘效应,?,何因？如何防止,?,B.,展开剂加入量,?,展开剂展开距离？,（,2,）展开方式,上行,近水平,双向,多次,3.展开（1）展开要求 查阅 A.何为边缘效应?,15,上行展开,近水平展开,上行展开近水平展开,16,4,检视,有色物质斑点,-,目光检视,无色物质斑点,荧光检出法,化学检出法,五、检测技术,1,系统适用性试验,检测灵敏度,比移值,分离效能,4检视有色物质斑点-目光检视无色物质斑点荧光检出法,17,2,鉴别,等浓度对照法,-,同板,-,大致同位、同大、同色泽,等体积混合法,-,斑点单一、紧密,结构相似对比法,-,R,f,不同或两斑点,3,杂质检查,杂质对照品法,样品溶液的自身稀释对照法,二者合用法,2鉴别等浓度对照法-同板-大致同位、同大、同色泽,18,4,定量方法,（,1,）目视比色法,-,半定量法（精度,10%,）,（,2,）斑点洗脱法,（,3,）薄层扫描法,(,正在减小使用,),4定量方法（1）目视比色法-半定量法（精度10,19,第,4,节 纸色谱分离技术,一、分离原理,(,液,-,液萃取,),利用样品中不同组分在两相溶剂中溶解性（或分配系数）不同，当流动相携带样品流经固定相（被吸附或固定在惰性材料上的液体）时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取、再溶解、再萃取，,，样品经过多次反复分配后，造成分配系数稍有差异的组分移行的距离不同面实现分离,.,二、仪器与材料,1,色谱滤纸,想一想,:,色谱滤纸如何选择,?,第4节 纸色谱分离技术 一、分离原理(液-液萃取)二、仪器,20,2,展开剂,（,1,）纸色谱一般固定相是什么,?,（,2,）纸色谱展开剂如何选择,?,3,展开容器,圆形或长方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃盖且能密闭,下行纸色谱展开缸,2展开剂（1）纸色谱一般固定相是什么?（2）纸色谱展开剂如,21,三、操作技术,1,色谱滤纸的准备,（,1,）用于下行法的色谱滤纸,（,2,）用于上行法的色谱滤纸,2,点样,样品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量毛细管或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后，俟其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干，点样,直径为,2 mm,4mm,，点样量取决于色谱滤纸的薄厚程度和显色剂的灵敏度，一般几到几十微克。,点间距离约为,1.5cm,2.0cm,，样点通常为圆形，也可点成条形。,三、操作技术1色谱滤纸的准备（1）用于下行法的色谱滤纸（,22,3,展开,纸色谱下行展开,纸色谱上行展开,3展开纸色谱下行展开纸色谱上行展开,23,4,斑点定位,纸色谱法斑点的定位基本和薄层色谱法相似，但纸色谱法不能使用腐蚀性显色剂，也不能在高温下显色。,运用纸色谱进行药物的鉴别、检查和含量测定的方法、要求与薄层色谱法一致,4斑点定位纸色谱法斑点的定位基本和薄层色谱法相似，但纸色谱,24,第,5,节 应用案例,一、柱色谱法的应用案例,案例,8-1,黄芪含量测定中样品溶液的制备,1,黄芪中主要活性成分是什么,?,如何提取和纯化,?,2.,提取液用氨试液洗涤的目的是什么,?,3.D101,水洗和,40%,乙醇液洗脱液为何弃去,?,二、薄层色谱法应用案例,案例,8-2,六味地黄丸中牡丹皮的鉴别,1.,牡丹皮 的鉴别指标是什么,?,鉴别原理是什么,?,2.,为何选择环己烷,-,乙酸乙酯（,3:1,）为展开剂,?,显色方式是什么,?,第5节 应用案例一、柱色谱法的应用案例 案例8-1 黄芪含,25,3,鉴别结果,六味地黄丸薄层色谱图（,1.,丹皮酚；,25.,六味地黄丸,）,3鉴别结果 六味地黄丸薄层色谱图（1.丹皮酚；25.六味,26,案例,8-3,甲苯咪唑中有关物质检查,1.TLC,法检查杂质常用有哪些方法,?,2.,检查中为何采用硅胶,GF254?,3.,甲苯咪唑中有关物质的限度是多少？,案例8-3 甲苯咪唑中有关物质检查 1.TLC法检查杂质常,27,