单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,概论,它结合了凝胶区分力高和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无需对靶蛋白进展同位素标记。几乎总在变性条件下进展，可以避开溶解、聚拢以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题。,具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转移到固相膜上的蛋白质进展连续分析，具有蛋白质反响均一性，固相膜保存时间长等优点。,被广泛地用于蛋白质争论，根底医学和临床医学的争论。,溶解蛋白策略,1 使用猛烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来，但这可能导致免疫反响性的丧失。,2 承受温顺的条件以助于保持蛋白质的自然状态，但这造成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。,机械裂开细胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细胞外表蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的反抗力，变性蛋白比自然蛋白更简洁降解。,往往可以依据靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性质来调整提取的条件。,为尽可能削减可能消失的问题，可设法承受多克隆抗血清或多种单克隆抗体的混合物，由于他们可与某一蛋白的多种形式起反响。,溶解方法,溶解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质：,1 表达靶蛋白的细菌一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解。,2 酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后制备提取液。,3 哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于SDS凝胶加样缓冲液。,4 哺乳动物细胞可用去污剂温顺裂解。假设靶抗原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓冲液裂解。,细胞预备,用PBS洗两次细胞，参加细胞裂解液，用橡胶刮子刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变得很粘稠。吸入1.5ml离心管。,超声打碎染色体DNA,直至溶液不粘为止。,4度，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。,有必要时重复上一步骤。,上清用于做SDS-，如不能马上做，可将上清转入另一Eppendorf-80C保存,留意事项,细胞裂解液的量,超声的频率，时间，次数。插得深不起泡沫。,检测蛋白的敏感性15ng,0.75mm厚的SDS的一个孔大约上100ug的总蛋白。,只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可被检测。,未知蛋白应同时作阳性比照。,主要试剂,RIPA华舜公司,苯甲基磺酰氟PMSF华舜公司,丙烯酰胺Amresco公司,双丙烯酰胺Amresco公司,丽春红染料华舜公司,Tween 20Amresco公司,过硫酸铵Sigma公司,四甲基乙二胺TEMEDSigma公司,硝酸纤维素膜Amersham公司,考马斯亮兰Fluka公司,兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体Santa Cruz公司,Phototope-HRP Western Blot Detection SystemCell Signaling Technology公司,仪器与设备,低温超速离心机Eppendorf公司,分光光度计Eppendorf公司,ThermomixerEppendorf公司,电泳仪Bio-Rad 公司,垂直式电泳槽Bio-Rad 公司,硝酸纤维素膜电转系统Bio-Rad 公司,配制试剂,10电泳Buffer,称取Tris-base 30.3克,glycine 144克 加去离子水，定容至1000ml,SDS 10克,1.5M Tris.HCl PH 8.8,称取18.15克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至8.8，定容100ml,0.5M Tris.HCl PH6.8,称取6.0克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至6.8，定容100ml,转膜缓冲液,称取3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml，临用前加200ml甲醇,10*：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml。,配制试剂,30Acry-Bis,29克丙烯酰胺1克双丙烯酰胺，加ddH2O 100ml配成，避光4保存,10过硫酸胺，新颖配制，=滤纸 胶,就行，你转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是渐渐变高的，最终完毕时一般是开头的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。,疑难杂证,电泳时Marker 按说明加5ul，但电泳中看不见，是失活了吗？参加20ul即可。,蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了，为什么了？可能是1样品浓度过低2转移时间不够。,一抗量较少，同时不知道一抗的最正确稀释比例是多少，怎么做呢？确定试验过程无污染后，将含抗体的稀释液回收，保存于-70。最好第一次的浓度做高一点，这样，假设结果不好，可以尝试再稀释。,免疫沉淀法检测表达蛋白,可用于检测并定量分析多种蛋白质复合物中的靶抗原。,很敏感，可检测出100pg的放射性标记蛋白。,当与SDS-并用时，即可用于分析外源基因在原核和真核宿主细胞中的表达状况。,操作步骤,靶蛋白的放射性标记,裂解细胞,特异性免疫复合物的形成,免疫复合物的收集和纯化,放射性标记蛋白质的免疫沉淀分析,靶蛋白的放射性标记,同位素通常是35S，其半衰期为87.1天，同位素是以35S标记蛋氨酸或35S蛋氨酸和半胱氨酸。,这些氨基酸是哺乳动物细胞的必需氨基酸，必需由培育基中供给。,培育基中含有高浓度的蛋氨酸和半胱氨酸，为了增加同位素标记氨基酸的渗入率，可去除培育基中的蛋氨酸或同时去除蛋氨酸和半胱氨酸。,同位素标记的强度取决于被检蛋白的合成速度和其氨基酸的组成，以及该蛋白质的代谢速度。,免疫复合物的收集和纯化,用耦联葡萄球菌蛋白A和Sepharose进展吸附：结果清晰，但本钱高，并且所需抗体有种系特异性的限制。,用经热致死并经甲醛固定的S.aureus细胞进展吸附：背景高，但是经济。,用抗被检蛋白抗体的抗体进展吸附，这种方法用于以下两种状况：1第一抗体的FC不能被葡萄球菌蛋白质A识别；2对被检蛋白进展定量分析时。,