*,第九节、肉毒梭状芽孢杆菌检验,一、肉毒梭状芽孢杆菌的生物学特性,1、,形态与染色,肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，革兰氏染色阳性(老龄菌是阴性），约为41m的大杆菌，多单在，偶见成双或短链，两侧平行，两端钝园，直杆状或稍弯曲，芽胞为卵圆形，大于菌体宽度，位于次极端，使菌体呈匙形或网球拍状，偶有位于中央，常见很多游离芽胞。有48根周生鞭毛，,运动迟缓，,无荚膜。,第九节、肉毒梭状芽孢杆菌检验一、肉毒梭状芽孢杆菌的生物学特性,1,2、培养特性,最严格的厌氧菌,生长最适温度：28 37 ：pH为6.87.6，产毒的最适pH为7.8 8.2。,产毒培养温度：不同菌型产毒的最适培养温度不完全相同。C、D型温度高些为宜，35 培养3d即可，而E型菌低温度长时间培养效果较好。,对营养要求不高：在普通培养基上都能生长。,肉毒梭状芽孢杆菌菌落,在固体培养基表面上，形成类圆形，边缘不整齐，约3毫米左右的菌落。菌落半透明，表面一般比较光滑也有的呈颗粒状，界线不明显，向外扩散。呈绒毛网状，常常扩散成菌苔。,2、培养特性最严格的厌氧菌肉毒梭状芽孢杆菌菌落,2,2、培养特性,在含有肉渣的液体或者半流动培养基中，肉毒梭菌生长旺盛且产生大量气体，A、B、F三型表面浑浊，底部有粉状和颗粒状沉淀，并能消化肉块，变黑有臭味；而C、D、E三型表明清亮，絮片状生长，粘贴于管壁。,肉毒梭状芽孢杆菌菌落,在葡萄糖鲜血琼脂平板上，菌落较小，扁平，颗粒状。中央低落，边缘不规则，有的菌落还有大的溶血环。,在卵黄琼脂平板上生长，菌落及其培养基周围表面覆盖着特有的彩虹样薄层，但G型没有。,2、培养特性在含有肉渣的液体或者半流动培养基中，肉毒梭菌生长,3,肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同型，也常见到株间的差异。,3、肉毒梭菌的生化特性,表1 各型肉毒梭菌的生化反应,肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同型，也常见到株间的差异。3,4,二、,肉毒梭菌的致病性,肉毒梭菌能产生,外毒素,即肉毒毒素（大分子蛋白），根据毒素的抗原特异性将其分为A、B、C（1、2）、D、E、F、G七个型别。与毒素型别相对应，肉毒梭菌也分为同样的七个型别。,其中A、B、E、F四型毒素对人有不同程度的致病性。,A,型毒素经,60,2,分钟加热，差不多能被完全破坏，而,B,、,E,二型毒素要经,70,2,分钟才能被破坏；,C,、,D,二型毒素对热的抵抗更大些；,C,型毒素要经过,90,2,分钟加热才能完全破坏，不论如何，只要煮沸,1,分钟或,75,加热,5,10,分钟，毒素都能被完全破坏。肉毒毒素对酸性反应比较稳定，对碱性反应比较敏感。某些型的肉毒毒素在适宜条件下，毒性能被胰酶激活和加强。,二、肉毒梭菌的致病性 肉毒梭菌能产生外毒素即肉毒,5,致病机理,肉毒毒素是一种神经麻痹毒素，主要抑制神经末梢释放乙酰胆碱，引起肌肉松弛麻痹，特别是呼吸肌麻痹导致死亡。,肉毒毒素的毒性极强，是目前已知在天然毒素和合成毒剂中毒性最强的生物毒素，据称，精制毒素1克能杀死400万吨小白鼠，一个人的致死量大概1微克左右。,肉毒中毒一年四季均可发生。美国以罐头发生中毒较多，日本以水产品较多；我国以发酵食品（如：臭豆腐、豆瓣酱、豆豉等）发生中毒较多。,致病机理,6,三、检验方法,1、检验标准：,GB 4789.12-2003,2、培养基和试剂,培养基：,庖肉培养基、卵黄琼脂培养基、明胶磷酸盐缓冲液。,试剂：,肉毒分型抗毒诊断血清、胰酶（活力1:250）、革兰氏染色液。另需实验动物（小白鼠）。,三、检验方法1、检验标准：GB 4789.12-2003,7,3、,检验程序,检 样,毒素检测,增菌、产毒培养,30，5 d,报告,（一）,毒素检测,报告（二）,分离培养,培养检查,毒素检测,报告（三）,增菌产毒培养,30，5 d,观察生长性状，,染色镜检,观察菌落性状,染色镜检,报告(一)：,检样中有无肉毒毒素以及有何型肉毒毒素。(如仅为了肉毒中毒诊断，即可结束检验),报告(二)：,对增菌产毒培养物，一方面做生长特性观察，同时检测肉毒毒素。报告检样中有无肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌。（有些样品如土壤、泥沙等基本上不可能含有毒素，则应从培养着手）,报告(三)：,欲获纯菌株，可用增菌产毒培养物进行分离培养，对所得纯菌株进行形态、培养特性等观察及毒素检测，其结果可证明所得纯菌为何型肉毒梭菌。（一般情况下，没有必要从检样中分离纯的菌株，但研究或特殊需要例外）,3、检验程序检 样毒素检测增菌、产毒培养报告毒素检测报告,8,（1）、肉毒毒素检测,注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24 h内发病、死亡。,液态或固体（明胶磷酸盐缓冲液）样品经过适当处理后离心，取上清液实验,上清液及其胰酶激活处理液,分别进行小白鼠腹腔注射，各3只，每只0.5 mL，观察4 d,确证试验,毒力测定,定型试验,（1）、肉毒毒素检测注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在,9,取庖肉培养基三支，煮沸10min15min，做如下处理：,第一支：,急速冷却，接种检样均质液1 mL2 mL；,第二支：,冷却至60，接种检样，继续于60保温10 min，急速冷却；,第三支：,接种检样，继续煮沸加热10 min，急速冷却。,以上3支试管于30厌氧培养5d，若无生长，可再培养10d。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同上，,阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。,（2,）、肉毒梭菌的检出（增菌产毒培养试验）,取庖肉培养基三支，煮沸10min15min，做如下处理：（,10,选取证实含有肉毒毒素的增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜的加热处理）接种卵黄琼脂平板，,35,厌氧培养,48 h,。肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样,(,或珍珠层样,),薄层,，但G型菌无此现象。,根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，于,30,培养,5d,，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。,（3）、分离培养,（1）毒素检测：试验方法同上。（2）培养特性检查：接种卵黄琼脂平板，分成两份，分别在35的需氧和厌氧条件下培养48 h，观察生长情况及菌落形态。肉毒梭菌只在厌氧条件下生长而在需氧条件下不生长。,选取证实含有肉毒毒素的增菌产毒培养物（必要时可重复一,11,4、结果报告,报告(一)：检样含有某型肉毒毒素。报告(二)：检样含有某型肉毒梭菌。报告(三)：由样品分离的菌株为某型肉毒梭菌。,肉毒梭菌检验目标主要是毒素，不论食品中的肉毒毒素检验还是肉毒梭菌检验，均以毒素的检测及定型试验为判定的主要依据。,4、结果报告报告(一)：检样含有某型肉毒毒素。报告(二)：,12,