单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,病毒分离技术（四）,中和抗体测定,目的,评价人群中抗脊灰病毒的免疫状态。,评价,OPV,的有效性和免疫效果。,适用范围,人群脊髓灰质炎中和抗体效价的测定。,免疫成功率的监测。,病毒分离技术（四）,中和抗体测定,必备材料,待检血清（灭活处理）,稀释液（,MM,）,细胞悬液,5,1010,4,/ml,标准血清（,WHO CDC/EPI,）,标准病毒（,Sabin,）,（滴度,10,6.0,CCID,50,/ml,）,必备材料,96,孔微量板,微量可调式移液器,无菌吸尖,/,无菌吸管,无菌,1.5ml,离心管,/,试管,封板胶带,CO,2,孵箱,病毒分离技术（四）,中和抗体测定,待检血清稀释（,14,11024,）,每份待检血清的稀释在,型板的,第,1,排进行。,0.15ml,稀释液，加入,0.05ml,的血清，,吹吸均匀后，将这个稀释度的血清向下一个稀释度移,0.05ml,，至最高稀释孔吹吸均匀后，弃去,0.05ml,。,（在微量板上进行，板子标记和稀释详见附录,1,）,型板,血清,1,血清,2,血清,3,血清,4,血清对照,14,血清稀释,14,116,164,1256,11024,血清对照,14,血清稀释,14,116,164,1256,11024,血清,5,血清,6,血清,7,血清,8,病毒分离技术（四）,中和抗体测定,稀释度,1,：,4 1,：,16 1,：,64 1,：,256 1,：,1024,稀释液,0.15 0.15 0.15 0.15 0.15,血 清,0.05 0.05 0.05 0.05 0.05,废,0.05,移入它孔（每孔,5,）,0.025 0.025 0.025 0.025,待检血清稀释方法示例：,病毒分离技术（四）,中和抗体测定,待检血清稀释,用排枪向第,2,排孔及,、,型板的相应稀释度的两排孔中，每孔移入,0.025ml,，原稀释孔保留,0.025ml,。,标准血清稀释（根据血清效价而定）,standard serum:18000,standard serum:12000,standard serum:12000,病毒分离技术（四）,中和抗体测定,标准毒株稀释（,200CCID,50,/0.025ml,）,（病毒滴定及攻击病毒含量的计算与稀释见附录,2,、,3,）,中和试验时所用抗原量过大或过小都会影响血清抗体滴度。每次试验应设病毒对照，核对所用病毒剂量，一般应在,32,320CCID,50,/0.025ml,的用量时其结果才被认可。,（病毒滴定对照见附录,4,）,病毒分离技术（四）,中和抗体测定,中和作用，,向血清板上加入已稀释好的标准毒株悬液,0.025ml,（,200CCID,50,）。,（注意型别的区分和对应）,轻摇混匀后，放入,CO,2,孵箱，培养,2,4,小时,加入事先准备好的细胞悬液,0.1ml/,孔,Hep-2:5,1010,4,/ml,再次摇匀，密封好放在,36.5,培养,5,7,天,。,病毒分离技术（四）,中和抗体测定,对照的设立,血清对照（,14,），标准血清和待检血清同时设立,细胞对照、稀释液对照,100CCID,50,的抗原对照,每个对照设两孔，血清、抗原的量各为,0.025ml/,孔,，补加稀释液,0.025ml/,孔,，细胞对照孔的稀释液应为,0.05ml,，然后全部加细胞悬液,0.1ml/,孔,，密封后放,34.5,培养,5,7,天,。,病毒分离技术（四）,中和抗体测定,结果判定,当,100CCID,50,的抗原对照出现完全病变时，判定最终结果,当最高稀释度的血清病毒混合液接种的,2,孔细胞中有,1,孔不出现,CPE,，该稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体滴度。,型板,血清,1,血清,2,血清,3,血清,4,血清对照,14,血清稀释,14,116,164,1256,11024,血清对照,14,血清稀释,14,116,164,1256,11024,血清,5,血清,6,血清,7,血清,8,病毒分离技术（四）,中和抗体测定,CCID,50,100,Sabine,10,1,0.1,100,Sabine,10,1,0.1,100,Sabine,10,1,0.1,病毒滴定结果判断示意图,10,0,1,病毒分离技术（四）,中和抗体测定,Spearsman,Karber,公式：,LogCCID,50,=Xm,1/2d,d,（,Pi/100,）,Xm=,所用病毒最低稀释度（最高浓度）的对数,d=,稀释度系数（倍数）的对数。,Pi=,各稀释度出现,CPE,百分数的总和,。,病毒分离技术（四）,中和抗体测定,病毒滴定结果的判定,Sabine,：,LogCCID,50,=0+0.5-1,（,100+100+100+25,）,/100=-2.75,Sabine,：,LogCCID,50,=0+0.5-1,（,100+75+25,）,/100=-1.50,Sabine,：,LogCCID,50,=0+0.5-1,（,100+100+50,）,/100=-2.00,病毒分离技术（四）,中和抗体测定,病毒滴定对照结果的判断,Sabine,：取,2.75,的反对数，即得到攻击病毒的含量：,562,CCID50/0.025ml,。,Sabine,：取,1.50,的反对数，即得到攻击病毒的含量：,31.6,CCID50/0.025ml,。,Sabine,：取,2.00,的反对数，即得到攻击病毒的含量：,100CCID50/0.025ml,。,病毒分离技术（四）,中和抗体测定,简单的判定是否有效的方法：,32,320,CCID,50,/0.025ml,的对数：,1.505,2.505,（,1.5,2.5,）,1.5,2.5,的反对数：,31.62,316.2,（,32,320 CCID,50,/0.025ml,）,题外话,感谢大家多年来对免疫预防工作的支持,新的问题不断涌现，促使我们不断的向前,未来，任重而道远,Thank you very much!,