Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,动物与家蚕的转基因技术,第一页，共49页。,转 基 因 技 术,第二页，共49页。,转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（,Transgene technology,）。人们常说的,遗传工程,、,基因工程,、,遗传转化,均为转基因的同义词。经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为,遗传修饰过的生物体,（,Genetically modified organism,，简称,GMO,）。,第三页，共49页。,Genetically Modified,转基因，简称,GM,。是指运用科学手段从某种生物中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中，使与另一种生物的基因进行重组，从而产生特定的具有变异遗传性状的物质。利用转基因技术可以改变动植物性状，培育新品种。也可以利用其它生物体培育出期望的生物制品，用于医药、食品等方面。,第四页，共49页。,转基因动物就是基因组中含有外源基因的动物。它是按照预先的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术，有可能育成转基因动物。通过生长素基因、多产基因、促卵素基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、角蛋白基因、抗寄生虫基因、抗病毒基因等基因转移，可能育成生长周期短，产仔、生蛋多和泌乳量高，转基因超级鼠比普通老鼠大约一倍。生产的肉类、皮毛品质与加工性能好，并具有抗病性，已在牛、羊、猪、鸡、鱼等家养动物中取得一定成果。,转基因动物,第五页，共49页。,1.,转基因绵羊,第六页，共49页。,2.,转基因鲤鱼,第七页，共49页。,1,转基因动物的发展,1980,年，等人首次报道用显微注射的方法向小鼠胚胎注射纯化的,DNA,，开辟了转基因动物研究的先河。,1982,年，等又报道用转移生长激素基因的方法，获得了,7,只转基因鼠，其中,1,只比一般小鼠大一倍，被称为巨鼠，引起极大的轰动。相继有转基因猪、鱼、兔和羊等问世。,第八页，共49页。,第九页，共49页。,国外转基因动物首创记录,年份,研究者,基因,/,转入方法,转入动物,结果,1980,Gordon,HSV-TK,小鼠,78,只子鼠中有,2,只为转基因鼠,1981,Constantini,兔珠蛋白基因,小鼠,24,只子鼠中,9,只为转基因鼠,1982,Palmiter,将,MT,启动子和大鼠,GH,基因接成的融合基因,侏儒小鼠,7,只转基因中,1,只生长加快，明显增大,1985,Wagner,拼接有,NEO,基因的逆转录病毒,小鼠,获得整合体小鼠,1985,Hammer,制备转基因,兔、羊、猪,均获得成功,1986,Robertson,MPSA-mos-Neo,逆转录病毒,感染,ES,细胞,得到可遗传的转基因动物,1987,Thomas,利用,ES,细胞法结合同源重组技术,小鼠,制备出,Hprt,基因定点突变的转基因小鼠,1988,Biery,牛,转基因牛成功,1990,Hochi,大鼠,转基因大鼠成功,1994,Love,线性质粒,鸡,7,只鸡活到性成熟，,1,只公鸡给后代传递外源基因,1994,Ono,基因微注射,鹌鹑,有,46.6%,胚体表达了外源基因,1998,Wilmut,绵羊乳腺细胞,绵羊,体细胞核克隆，获得绵羊“多利”,第十页，共49页。,年份,单位及研究者,基因,/,转入方法,转入动物,结 果,1984,发育所,陆德裕等,人珠蛋白,小鼠,个体大，基因可连续传递，但表型似不能保持,1986,发育所,史瀛仙等,牛及人,生长激素,小鼠,DNA,能转录成,RNA,的小鼠体型大，未能转录成,RNA,的小鼠体积小，说明基因在体内一定要转录成,RNA,，并翻译成蛋白质，才能起促进生长的作用。,1987,发育所,于建康等,大肠杆菌,galk,基因,小鼠,产,21,只，,2,只,DNA,中含有大肠杆菌,galk,基因,1995,北京农大,陈永福等,ZPL,线性化的,DNA,导入猪受精卵,猪,获转基因猪，为避免猪过早死亡，采用传代、后诱导表达法,1996,中国农科院畜牧所,黄少华等,微注射,SMT-PGH,基因到猪早期胚胎,猪,妊娠率随移入胚胎数的增多而提高，以,20-30,为宜,1997,江苏农科院,范必勤等,用体外获能的精子为载体，通过体外受精导入基因,猪,建立新的基因导入方法,1998,上海医学遗传研究所,曾溢滔等,人凝血因子,山羊,产出,5,只转基因羊，其中,1,只母羊乳汁中含有人凝血因子,1999,上海医学遗传研究所,曾溢滔等,人血清蛋白,奶牛,移植,8,头牛，妊娠,3,头，生产,1,头公牛，携带有人血清蛋白基因,国内转基因动物首创记录,第十一页，共49页。,经典的技术路线,先从已交配的供体动物的输卵管中采取受精卵；,显微注射法向受精卵的雄性核导入人工构建的药物蛋白基因；,经外科手术把已导入外源基因的受精卵移入同步发情的受体母羊输卵管内；,让受精卵在“养母”体发育至分娩出生；,用分子生物学技术检测出生小羊是否已整合了导入的外源基因。,该法的缺点：实验周期长，注射的外源基因整合率低。,3.,转基因动物的技术路线,第十二页，共49页。,整合胚胎移植技术路线,该技术是对前种方法的改进。它利用了生殖技术中的体外受精技术，使精子和卵子在体外受精；然后找到一个最佳时机向体外受精的细胞显微注射药物蛋白基因。然后在体外对胚胎体进行整合的鉴定。从中挑选有目的基因整合的胚胎进行移植。采用经阴道的非手术胚胎移植法，减少了对受精卵的损伤。,第十三页，共49页。,第十四页，共49页。,核移植（克隆）技术路线,利用克隆技术进行转基因实验。即在进行克隆之前，先目的基因注射到将进行移植的核中，在按克隆技术进行操作。其成功率比经典技术路线高,2.5,倍。,整合卵受精技术路线,即在受精之前先将药物蛋白基因注射进入卵细胞，经检测已经完成整合后，再进行体外受精和胚胎移植。,第十五页，共49页。,第十六页，共49页。,A.,互补,DNA(cDNA),的克隆,通过提取组织中的,mRNA,用反转录酶合成,cDNA,，建立,cDNA,文库，再克隆目标蛋白的,cDNA,。由于,cDNA,缺乏内含子，影响基因导入后的表达效率。,B.DNA,克隆,首先建立动物的,DNA,文库，再通过基因克隆技术获得编码目标蛋白的基因，这是获得目标基因最常用的方法。,目标基因被克隆以后需与表达载体相连结，形成一个独立表达的调控单元，再通过扩增和纯化，使,DNA,达到一定浓度就可用于基因导入受体。,目前获得目标基因的途径有两种方法：,第十七页，共49页。,基因导入的方法,A.,反转录病毒感染法,(retrovirus infection),B.,显微注射法,(microinjection),C.,胚胎干细胞法,(ES cell transfer method),D.,精子载体法,(Sperm-mediated gene transfer),E.,生殖细胞转染法,(Germ cell transfected),F.,细胞核移植法,(Cell nuclear transfer),第十八页，共49页。,A.,反转录病毒感染法,反转录病毒是双链,RN,病毒，它侵染细胞后可通过自身的反转录酶以,RNA,为模板在寄主细胞染色体中反转录 成,DNA,。在利用病毒载体转基因时，首先要对病毒基因组进行改造，将外基因插入到病毒基因组致病区，然后用此病毒感染胚胎细胞，即可对胚胎细胞进行遗传转化。如果在第一次卵裂之前外源,DNA,整合到胚胎基因组中，可获得转基因动物，在第一次卵裂之后整合，会产生嵌合体，其第二代可能出现转基因动物。,优点,:,方法简单，效率高，外源,DNA,在整合时不发生重排，单位点、单拷贝整合，并且不受胚胎发育阶段的限制。,缺点,:,携带外源基因的长度不超过,15kb,，载体病毒基因有潜在致病性，威胁受体动物的健康安全。,第十九页，共49页。,第二十页，共49页。,B.,显微注射法,(microinjection),第二十一页，共49页。,第二十二页，共49页。,C.,胚胎干细胞法,这种方法首先是用外源基因转化胚胎干细胞，通过筛选，把阳性细胞注入受体动物的囊胚腔中，生产嵌合体动物，当胚胎干细胞分化为生殖干细胞时外源基因可通过生殖细胞遗传给后代，在第二代获得转基因动物。,优点,:,对阳性细胞进行选择，实现外源,DNA,的定点整合。,缺点,:,第一代是嵌合体，获得转基因动物的周期较长。,第二十三页，共49页。,第二十四页，共49页。,D.,精子载体法,它是利用哺乳动物的精子能结合外源,DNA,的特性，通过受精过程把外源,DNA,导入受精卵，获得转基因动物。,优点,:,方法简单，转基因效率高。,缺点,:,效果不稳定，外源,DNA,分子可能会受到受精液中内切酶的作用而影响整合后的功能。,第二十五页，共49页。,第二十六页，共49页。,E.,生殖细胞转染法,第二十七页，共49页。,F.,细胞核移植法,这种方法是随着哺乳动物体细胞核移植技术的发展而建立的。首先用外源,DNA,对培养的体细胞或胚胎干细胞进行传染，然后选择阳性细胞作核供体，通过细胞核移植，获得基因动物。这种方法是非常理想的转基因手段，因为它可与基因靶技术结合，实现外源基因的定点整合，消除外源,DNA,随机整合带来的负作用。这种方法的转基因效率可达,100%,，大大降低转基因家畜的生产成本。,第二十八页，共49页。,第二十九页，共49页。,检测的方法,A.,外源基因的整合检测,它是检测动物基因组中是否携带外源,DNA,。常用的方法是用目标基因的一段序列作引物，,PCR,仪扩增目标,DNA,，再通过电泳初步检测是否含有目标基因。然后，用,Southern,杂交检测,PCR,阳性个体是否含有目标基因，如果出现阳性，就可断定为转基因阳性动物。,B.,外源基因的转录检测,它是用,Northern,杂交法对转基因动物某一组织的,mRNA,进行分析检测，出现阳性表明外源基因具有转录活性。,C.,外源基因的表达检测,它是检测转基因动物组织中是否含有目标基因编码的外源蛋白质，常用的方法有酶联免疫法、免疫荧光法和,Western,杂交法。,第三十页，共49页。,第三十一页，共49页。,转基因动物的应用,在医学上,A.,制备动物疾病模型,与疾病相关的基因被克隆后,通过转基因技术制备动物疾病模型,可用来研究疾病的发生、发展规律和治疗药物的筛选,以此确定确定此疾病的最佳治疗方案。目前，在世界范围内发现人类的遗传疾病有,3500,多种,已建立约,15,种转基因疾病模型，其中包括糖尿病、高血脂症、,地中海或镰刀型贫血症，阿尔茨海默氏病,(Alzheimers Disease),动脉粥样硬化症等常见的疾病。,第三十二页，共49页。,B.,用以研究癌基因的活动规律和肿瘤的发生机理。,如,SV40,的启动子与胰岛素或晶状体蛋白基因重组后,制备的转基因动物出 现胰腺瘤或晶状体瘤,进一步研究发现,SV40,启动子的,72,个核苷酸与肿瘤的发生有密切关系,已建立乳腺癌和前列腺癌的小鼠。,C.,用以治疗遗传疾病,随着人类基因组计划的完成和基因定点整合技术的成熟，转基因技术有可能治愈人类的遗传疾病。,D.,生产人的代用器官,用表达病人补体调节蛋白基因或敲除细管内皮细胞表面抗原决定簇基因猪的器官可替代人的患病器官,延长病人的寿命。,第三十三页，共49页。,家蚕篇,第三十四页，共49页。,转基因家蚕所用载体,转基因载体是一类装