,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验肿瘤学根本概念,肿瘤发生开展的一般过程,正常细胞 癌细胞 原位癌 浸润癌 转移癌,休 眠,预防,诊断,治疗,肿瘤细胞的生物学特点,自我满足的生长信号,对生长抑制信号不敏感,逃避凋亡,无限增殖的潜能,血管生成,浸润和转移,实验肿瘤模型的要求,忠实地重现人类肿瘤的生物学特性,实验肿瘤学的研究方法,直接研究,建立细胞系,建立动物模型,细胞系的根本概念,组织培养和细胞培养：模拟体内环境在体外培养机体组织和细胞，使之生存和生长。,原代培养primary culture:从体内取出组织和细胞的第一次培养。,传代passage：细胞长满培养瓶后，细胞分成2-3瓶继续培养。,细胞系cell line:原代培养细胞首次传代成功后的细胞，称细胞系。Finite cell line,continuous cell line,established cell line,细胞株(cell strain):通过选择或克隆，从亲代细胞系选出的带有特定标志的细胞群。,瘤株：在动物体内可传代的肿瘤细胞系。,ATCC American Type Culture Collection 美国模式培养物收集中心,美国菌种保存中心,培养细胞的生长方式,贴附生长型细胞：细胞附着于支持物外表生长。,上皮细胞型：来源于外胚层和内胚层的细胞，细胞为扁平多角形，细胞之间紧密相靠成片。,成纤维细胞型：来源于中胚层的细胞，细胞呈梭形，排列成漩状、放射状、栅栏状。,悬浮生长型：造血系统的细胞,培养细胞的生长特点,贴附生长：支持物可为玻璃、塑料、胶原、其他细胞等。停泊或贴壁依赖性细胞anchorage-dependent cell),接触抑制(contact inhibition)：正常细胞相互接触后，细胞将向另一个方向移动，从而使细胞不会重叠生长。,密度抑制(density inhibition)：正常细胞集合成片后细胞分裂停止，在静止状态下细胞存活一段时间 集合 confluent,培养条件,根本营养成分 RPMI1640 DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium)谷氨酰胺,生长因子 小牛血清 胎牛血清 灭活补体 56 30min,环境 37 pH 7.2-7.4 渗透压,无污染无毒 细菌、支原体,体外培养的优点,优点：1.活细胞，,2.对象均匀，易控制实验条件，易于观察和纪录实验结果,3.易研究单个细胞的结构和功能，易于进行分子生物学水平研究，,4.实验周期短，本钱低，细胞系可长期保存。,体外培养的缺点,1.在体外细胞生物学行为与在体内不完全一样，,G1 G0 终末分化,肿瘤细胞,M S,介质细胞 G2,2.转化transformation:在体外培养过程中细胞的遗传性状发生变化。分为一般转化和恶性转化。,一般转化：指细胞获得不死性。,恶性转化：指出现在软琼脂培养基中浸 润生长；在动物体内成瘤；血清依赖性降低；生长密度依赖性降低。,3.体外实验结果不能外推到体内实验,细胞培养的应用,研究细胞与环境的相互作用,细胞间的相互作用,细胞内胞质活动,细胞质与细胞核之间的流动,建立细胞系的根本要求,细胞在体外培养半年以上，生长稳定，保持细胞特征并能传代。,建系方法,1.,原代培养,：无菌操作，取肿瘤组织，切成小片，小于0.5毫米，进行培养，或用胰酶、胶原酶消化成单细胞悬液，血清灭活酶，培养,2.,传代,：待细胞长满培养瓶，胰酶消化，按1：2-3传代,3.,去除杂细胞,4.,冻存细胞,10%DMFO+90%胎牛血清，,4,30min,-20,2hrs,-70 过夜,液氮，长期保存。,登记，定期复苏细胞。,复苏：37 水浴，加培养基洗一次，培养,5.,鉴定,鉴 定,细胞形态观察,癌细胞多角型，重叠生长，,核浆比例失调，多核巨细胞,染色体分析,数量和核型、核带，标记染色体,细胞生长曲线和细胞周期,集落形成率,动物接种,成瘤，,组织形态学与原发肿瘤相似,污染,无病毒、,支原体污染,、,细胞间交叉污染,Hela cell:1951年 Henrietta Lack 宫颈癌,实验动物根底知识,法 规,1988年 中华人民共和国实验动物管理条例,1989年 医学实验动物管理实施细那么,1994年 关于在全国医疗卫生系统实行实验动物合格证制度得通知 医学实验动物合格证书，医学实验动物环境设施合格证书，医学实验动物全价营养饲料合格证书，医学实验动物饲料生产条件合格证书,1988年 广东省实验动物管理方法,根本概念,实验动物laboratory animal:指人工培育的、对其携带微生物实行控制、来源清楚、遗传背景清晰、可用于科学实验得动物。,实验用动物animal for research:能用于科学实验的动物，包括实验动物、野生动物、经济动物和欣赏动物。,标准化实验动物：有明确的遗传背景、繁殖方法、饲养环境、饲料成分均到达标准的实验动物。在科学研究中必须使用标准化实验动物。,实验动物的分类(遗传背景),近交系纯系：连续20代以上兄妹交配或亲子交配 而获得的遗传上到达一致的动物群。如BLAB/c小鼠。,杂交群:两个近交系动物间有方案进行交配获得的第一代动物。,封闭群：由同一血缘品系进行自由交配，在固定场所保存繁殖5年以上得动物群，如Wistar 大鼠、SD大鼠。,突变系：正常染色体基因突变导致遗传缺陷的动物，如裸鼠,按微生物控制分类,一级：普通动物，不携带人畜共患疾病病原体的动物。,二级：清洁动物，不携带人畜共患疾病病原体和动物传染病病原体的动物。,三级：无特定病原体的动物specific pathogen free,SPF,动物体内不存在特定病原微生物和寄生虫的实验动物。,四级：无菌动物，不存在微生物和寄生虫的实验动物。,一级动物只能用于教学和某些研究的预实验，卫生部以上课题和研究生课题必须使用二级以上动物,免疫缺陷动物,裸小鼠 nude mice,1962年英国发现。鼠11号染色体裸基因nu是隐性突变基因。,裸基因纯合子nu/nu鼠的特征:,1.全身无毛，裸体外表。,2.胸腺上皮细胞不能增殖，T细胞发育受阻，T细胞免疫缺陷。,3.B 细胞形态正常，功能较差，免疫球蛋白以 Ig M 为主，少量Ig G，类似于人原发细胞免疫缺陷。,随着鼠龄增加，T细胞增加，移植实验一般用4-8周鼠。,4.裸小鼠抵抗力差，易患病毒性肝炎和肺炎，应饲养在SPF 环境。,5.纯合型雌鼠不能生育，/nu/+和/nu/nu交配可获 1/2 纯合子鼠。,常用BALB/c nu/nu,Swiss nu/nu,NC nu/nu。,应 用,建立人肿瘤的裸鼠移植瘤模型,研究致癌机理：,1在裸鼠体内诱发人类肿瘤：EBV,2生物因素的致瘤性：多瘤病毒只在新生鼠或幼鼠诱发肿瘤，而在成年裸鼠也可在远离注射部位诱发肿瘤，在雌鼠为乳腺癌，雄鼠为骨肉瘤。,裸大鼠(nude rat),1953年苏格兰在远交系hooded大鼠中发现，因饲养不当而绝种。,1975年重新发现纯合子大鼠。纯合子 rnu/rnu 鼠无胸腺，缺乏功能性T细胞，抵抗力低下。,严重联合免疫缺陷鼠(severe combined immune deficiency mice,SCID),1982年美国发现于C.B-17/ICR品系。,Scid位于16号染色体，是隐性突变基因。,纯合子scid/scid,T细胞和B细胞功能缺陷,，血清中无免疫球蛋白，外周血淋巴细胞数量明显减少。NK 细胞功能正常。接受单克隆抗体杂交瘤移植后易形成腹水瘤，可获得高纯度的单克隆抗体。,SCID 鼠被毛发正常，雌雄可生育。,动物肿瘤模型,自发肿瘤,：动物自然发生的肿瘤，发病过程与人类肿瘤相似，但发病时间早晚不一，不易在短期内得到实验结果。,诱发肿瘤,：用化学、物理、生物等因素在动物体内诱发的肿瘤。物理、生物因素诱发肿瘤的潜伏期长，发生率不稳定，常用化学因子诱发肿瘤。常用于肿瘤,病因、化学预防,的研究,诱发肿瘤模型的根本要求,简单易行、易重复,选择对特定致癌物敏感的动物种系：,多环方香烃-皮肤/小鼠；甲基卞肼亚硝胺-食道癌/大鼠；甲基氨基偶氮苯-肝癌/大鼠,恰当的致癌物剂量：动物存活率高，诱发周期短。,诱发的肿瘤类似于人类肿瘤,原位诱发,：如：0.25二已基亚硝胺 0.251 ml 灌胃6月，70发生肝癌,异位诱发,：将与致癌物作用过的器官或组织移植于自体或同系、同基因正常动物皮下，诱发所需的肿瘤。如：甲基胆蒽穿线法穿入幼鼠子宫颈，将子宫颈切除，移植于同系成年小鼠皮下，3个月后诱发异位子宫颈癌,可移植性肿瘤,肿瘤组织在同种或异种动物体内传代后获得的生物学特性学相对稳定的肿瘤。,同种可移植性肿瘤,可分为实体瘤、腹水瘤、淋巴瘤、白血病 到1997年我国65株。,腹水瘤：将可移植性实体瘤接种于同种动物腹腔或腹壁，待肿瘤生长后形成腹水，再接接种于同系肿瘤。用于药物筛选。,异种可移植性瘤,：,免疫力正常动物：免疫隔离区 如眼前房、脑内，或免疫抑制，如X线照射/可的松 免疫缺陷动物,移植部位,原位移植orthotopic implantation,异位移植(ectopic implantation)皮下、肾包膜下、腹腔,可移植性肿瘤的参考标准,传15-20代以上,接种成活率100%，自发消消退率2年)的状态,此时肿瘤细胞处于G0期或增殖和凋亡相平衡。,微小转移灶micro-metastasis:在原发灶以外用常规临床检查方法不能发现的肿瘤病灶,微小残留灶：治疗后在原发灶遗留的小量肿瘤细胞,转基因动物肿瘤模型,理论根底：1 肿瘤是癌基因突变/抑癌基因失活的结果,2 基因功能在进化中是保守的,转基因动物,外源基因在动物染色体稳定整合并遗传给后代的动物。,用途：生物医药,基因表达调控,单基因表达调控,多基因表达调控,基因敲除knock out),转基因方法,DNA,逆转录病毒/DNA转染,胚胎干细胞,显微注射,受精卵 四细胞胚胎 囊胚 原肠胚 转基因动物,显微注射,逆转录病毒,DNA DNA,纤维注射与逆转录病毒转染的比较,转基因方式 显微注射 逆转录病毒转染,DNA导入 50kb,单细胞受精卵 10-15kb,46细胞卵,培养液 M16 高营养液,移卵 输卵管 子宫,整合 随机整合，多拷贝 随机整合，嵌合体，,单拷贝,表达 受旁侧序列影响 受病毒LTR影响，,在一定范围内表达水平 易缺失,与拷贝数成正比,传代 可传代 整合至生殖细胞的可传代,显微注射法建立转基因鼠的一般实验程序,供体母鼠,注射激素、交配,鼠受精卵,目的基因 显微注射,注射DNA的受精卵,假孕母鼠,娩出幼鼠,鉴定,C57BL/6肝癌模型,p53-/-+p53+/+HBV+p53+/-HBV+p53+/+,p53+/-HBV+P53+/-HBV-p53+/+HBV+P53+/+HBV-,AFB1 10mg/kg i.p,Group HBV p53 AFB1 SEX N HCC,Ia +/-+M 7,7/7,+/-+F 8,5/8,IIa +/+M 16,11/16,+/+F 6 0/6,IIIa -+/-+M 7 2/7,-+/-+F 9 1/9,IVa -+/+M 10 1/10,-+/+F 7 0/7,Ib +/-M 8 1/8,IIb +/+-F 5 0/5,