单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,生工学院生命科学系,蛋白质分子的大小,1.,蛋白质相对分子质量,1,万至几万,.,2 .,蛋白质相对分子质量的测定方法,根据化学组成测定最低相对分子质量,用物理化学方法来测蛋白质的相对分子质量,2024/11/19,1,蛋白质分子的大小1.蛋白质相对分子质量 1万至几万.,一,、蛋白质,两性解离和等电点,蛋白质分子中氨基酸残基的,侧链,上存在游离的,氨基,和,羧基,，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离性质，具有特定的,等电点（,pI,）,。,溶液,pH,pI,时,，蛋白质所带正负电荷相等；,pH,pI,时,，蛋白质带净负电荷；,pH,pI,时,，蛋白质带净正电荷。,2024/11/19,2,一、蛋白质两性解离和等电点蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在,蛋白质,两性解离和等电点,主要由肽链中可解离的功能团决定,两性解离：,蛋白质的等电点,P,I,：,蛋白质等离子点：,蛋白质电泳：用于蛋白质的分离鉴定。,2024/11/19,3,蛋白质两性解离和等电点主要由肽链中可解离的功能团决定202,等电点时特点：,（,1,）净电荷为零,（,2,）一定离子强度的缓冲液：等离子点特征常数,（,3,）多数蛋白质在水中等电点偏酸,碱性,AA/,酸性,AA,等电点,胃蛋白酶,0.2 1.,血红蛋白,1.7 6,细胞色素,C 2.9 10.7,菊糖酶,0.34 8.2,（,4,）导电性、溶解度、黏度及渗透压都最小。,等电沉淀和白泳：,迁移率与净电荷量、分子大小、分子形状等有关,2024/11/19,4,等电点时特点：（1）净电荷为零2023/10/84,等电点沉淀和电泳：,等电点沉淀：迁移率与净电荷量、分子大小、分子形状等有关,电泳：,带电粒子在电场中移动的现象称为,电泳,2024/11/19,5,等电点沉淀和电泳：等电点沉淀：迁移率与净电荷量、分子大小、分,蛋白质分子在一定,pH,的溶液中可带净的,负,电荷或,正,电荷，故可在电场中发生移动。,不同蛋白质分子所带,电荷量,不同，且,分子大小,也不同，故在电场中的移动速度也不同，据此可互相分离。,2024/11/19,6,蛋白质分子在一定pH的溶液中可带净的负电荷或正电荷，故可在电,二、蛋白质胶体性质,蛋白质溶液是胶体溶液,维持蛋白质的胶体系统稳定的因素,1,100nm,大小的质点在动力学上是稳定的,.,某一,pH,下质点带有同种电荷，互相排斥。可构成双电层,质点能与溶剂（水）形成水化层，相互间不易靠拢。,2024/11/19,7,二、蛋白质胶体性质蛋白质溶液是胶体溶液2023/10/8,2.,蛋白质具有胶体溶液的性质,蛋白质分子的颗粒直径已,达,1100nm,，处于胶体颗粒的范围。（亲水胶体）,蛋白质具有胶体溶液的性质：布朗运动、丁道尔现象、不能透过半透膜、具有吸附力等。,2024/11/19,8,2.蛋白质具有胶体溶液的性质蛋白质分子的颗粒直径已达11,3,、稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素：,水化膜,-,通过,氢键,与水结合,表面电荷,-,在非等电点状态下，,双电层,，带,同性电荷蛋白质分子互相排斥。,2024/11/19,9,3、稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素：水化膜 -,蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜,+,+,+,+,+,+,+,带正电荷的蛋白质,带负电荷的蛋白质,在等电点的蛋白质,酸,碱,酸,碱,脱水作用,脱水作用,脱水作用,2024/11/19,10,蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜+带正电荷的蛋白质,4.,蛋白质凝胶,凝胶具有胀润作用：,分类：,（,1,）,可逆性凝胶,（,2,）不可逆性凝胶,部分破坏水化膜、适当加热和远离等电点,2024/11/19,11,4.蛋白质凝胶凝胶具有胀润作用：2023/10/811,5.,蛋白质胶体性质的应用,1,、蛋白质是生物大分子,不能透过半透膜,2,、蛋白质溶液是稳定的胶体溶液,具有亲水胶体性质,3,、临床应用,维持有效循环血量、实验室透析技术,2024/11/19,12,5.蛋白质胶体性质的应用1、蛋白质是生物大分子 不能透,三、蛋白质的变性作用,吴宪教授是中国协和医科大学,(,原北京协和医学院,),生物化学系创始人，曾任中国生理学会会长。他早在,20,世纪,30,年代就提出了蛋白质变性理论，在中国和国际生物界有很高的学术地位和广泛的影响。,变性,复性,2024/11/19,13,三、蛋白质的变性作用吴宪教授是中国协和医科大学(原北京协和医,1.,蛋白质变性的本质,蛋白质分子中次级键被破坏，引起天然构象松散。不涉用共价键的断裂（肽键和二硫键），,蛋白质只有在比较温和的条件下才倾向于稳定。,温和条件指的是：,温度为,0,40,，,pH,范围为,5.59.0,，,没有有机溶剂。,2024/11/19,14,1.蛋白质变性的本质蛋白质分子中次级键被破坏，引起天然构象松,2.,导致蛋白质变性的因素,物理因素,高温、高压、超声波、剧烈振荡、搅拌、,X,射线和紫外线等；,化学因素,强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、重金属盐（,Hg,2,、,Ag,+,、,Pb,2,等）、三氯乙酸、浓乙醇等都能蛋白质变性。,2024/11/19,15,2.导致蛋白质变性的因素物理因素2023/10/815,3.,常用的变性剂,尿素：,与多肽主链竞争氢键；增加非极性侧链在水中的溶解度，从而降低疏水相互作用。,C,C,C,N,N,H,H,H,H,O,O,O,蛋白质肽链,尿素分子,2024/11/19,16,3.常用的变性剂尿素：与多肽主链竞争氢键；增加非极性侧链在水,4.,变性蛋白质的特点,生物活性丧失：,某些物理化学性质改变：,易与相应的试剂起化学反应；,溶解度降低，易形成沉淀析出；,结晶能力丧失；,分子不对称性加大；,粘度增加；,紫外吸收光谱有所改变；,肽键易被酶水解和消化。,2024/11/19,17,4.变性蛋白质的特点生物活性丧失：2023/10/817,5.,蛋白质的复性,当变性因素除去后，变性蛋白质又可重新回复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性。,可逆变性（三、四级结构）与不可逆变性（二、三、四）,不是所有的变性蛋白都能复性。大部分蛋白质变性后不能恢复其原有的各种性质,复性后的蛋白质多数不能完全恢复活力。,2024/11/19,18,5.蛋白质的复性当变性因素除去后，变性蛋白质又可重新回复到天,四、蛋白质的沉淀,改变稳定蛋白质胶体溶液的条件时，稳定性就被破坏，蛋白质分子相聚集而从溶液中析出，这种现象称为蛋白质的沉淀作用。,带正电荷的蛋白质,脱水作用,OH,-,H,+,在等电点的蛋白质,带负电荷的蛋白质,脱水作用,带正电荷的蛋白质,不稳定的蛋白质颗粒聚集而沉淀,带负电荷的蛋白质,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,OH,-,H,+,2024/11/19,19,四、蛋白质的沉淀改变稳定蛋白质胶体溶液的条件时，稳定性就被破,沉淀蛋白质的方法,、盐析法(salting out)：定义，原理，应用,、重金属盐法：pHpI PrM PrM,、生物碱试剂：三氯乙酸，单宁酸，苦味酸，钨酸等。,、有机溶剂法：定义，原理，注意,5、加热沉淀蛋白质,2024/11/19,20,沉淀蛋白质的方法、盐析法(salting out)：定义，,1.,盐析,中性盐沉淀,定义：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析,作用机制,:,中和电荷的同时破坏水化膜,;,2024/11/19,21,1.盐析中性盐沉淀定义：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以,2.,重金属盐沉淀,蛋白质分子在,PH,大于其等电点时，带负电，易与重金属离子如,Hg+,、,Pb2+,、,Cu2+,等结合生成不溶于水的蛋白质盐沉淀，引起蛋白质变性。,人误食重金属盐中毒是因为重金属盐与蛋白质沉淀变性有关，临床上采用口服大量新鲜牛奶、豆浆抢救重金属中毒的病人，就是根据牛奶、豆浆等蛋白质能与重金属盐结成不溶沉淀物，可阻止机体对重金属盐的吸收。然后用催吐剂将结合的重金属呕吐出来，达到抢救目的。,2024/11/19,22,2.重金属盐沉淀蛋白质分子在PH大于其等电点时，带负电，易,3.,生物碱试剂沉淀蛋白质,蛋白质分子在,PH,小于其等电点时，带正电，易于生物碱（苦味酸、三氯乙酸、磺基水杨酸等）结合，生成不溶性盐，引起蛋白质变性。,临床上用三氯乙酸作尿蛋白的检测试剂。,2024/11/19,23,3.生物碱试剂沉淀蛋白质蛋白质分子在PH小于其等电点时，带正,4.,有机溶剂沉淀法,与水互溶的有机溶剂，如酒精、甲醇等破坏蛋白质水化层，使得蛋白质沉淀。（在等电点下效果更好）,但是常温下，有机溶剂会引起蛋白质的变性，如酒精灭菌，而在低温下蛋白质变性减慢。因此利用有机溶剂沉淀蛋白质，为防止蛋白质变性，可在低温下进行，严格控制引起变性的各种因素。,2024/11/19,24,4.有机溶剂沉淀法与水互溶的有机溶剂，如酒精、甲醇等破坏蛋白,5.,加热沉淀蛋白质,加热使蛋白质变性,沉淀,蛋白质变性和,沉淀是二个不同概念,蛋白质变性不一定,沉淀,蛋白质,沉淀也不一定,变性,2024/11/19,25,5.加热沉淀蛋白质加热使蛋白质变性沉淀2023/10/825,五、蛋白质的呈色反应,蛋白质分子中某些氨基酸的侧链基团和肽键，可发生一些颜色反应。它们可用于某氨基酸的鉴定、蛋白质定性试验和定量测定。,2024/11/19,26,五、蛋白质的呈色反应蛋白质分子中某些氨基酸的侧链基团和肽键，,五、蛋白质的呈色反应,蛋白质的呈色反应就是氨基酸某些基团及肽键与一定试剂所产生的化学反应。利用这些反应，可对蛋白质进行定量测定。但是这些化合反应不是蛋白质的特征反应，在鉴定蛋白质时，除利用这些方法外，还必须结合蛋白质的其它性质考虑。,2024/11/19,27,五、蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应就是氨基酸某些基团及肽键,1.,双缩脲反应,蛋白质与碱性,Cu2+,形成紫红色络合物反应这是蛋白质分子中肽链的反应。肽链越多，反应颜色越深。氨基酸无此反应。可用于蛋白质定量、定性，也可用于蛋白质水解程度的测定,2024/11/19,28,1.双缩脲反应 蛋白质与碱性Cu2+形成紫红色络合物反应这,2.,福林试剂反应（酚试剂反应,）,福林试剂：磷钼酸,-,磷钨酸,在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应,蛋白质,-,铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物,2024/11/19,29,2.福林试剂反应（酚试剂反应）福林试剂：磷钼酸-磷钨酸202,3.,乙醛酸反应,在蛋白质溶液中加入,HCOCOOH,，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成。,色氨酸的反应（吲哚环的反应）,鉴定蛋白质中是否含有色氨酸,2024/11/19,30,3.乙醛酸反应在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管,4.,茚三酮反应,在,PH5.7,时，蛋白质与茚三酮可产生颜色反应。可用于蛋白质的定性和定量。,2024/11/19,31,4.茚三酮反应在PH5.7时，蛋白质与茚三酮可产生颜色反应。,六、蛋白质的免疫学性质,抗原：指能刺激机体免疫系统产生免疫应答，并能与相应的抗体特异性结合的物质。,抗体：由相应抗原刺激机体的免疫系统而由,-,淋巴细胞新产生的免疫球蛋白。换句话说，抗体是动物针对外来物质的出现而合成的一种蛋白质。,免疫反应：指抗原与抗体所引起的反应。,过敏反应：免疫反应拌有组织损伤或生理功能紊乱。,2024/11/19,32,六、蛋白质的免疫学性质抗原：指能刺激机体免疫系统产生免疫应答,第五节蛋白质的提取、分离和纯化的基本原理,蛋白质的分离纯化是研究其结构与功能的基础。在生物制药工业中，蛋白质、酶、多肽类激素等药物生产制备都涉及到蛋白质分离纯化的问题。蛋白质分离纯化的工艺过程，既要考虑尽可能的除去杂蛋白，又要保持目的蛋白的产量，也就是要提高回收率,。,2024/11/19,33,第五节蛋白质的提取、分离和纯化的基本原理蛋白质的分离纯化是,一、提取,1.,选材：新鲜、富含目的蛋白且来源方便,2.,组织细胞的粉碎：胞内及膜中蛋白,1,）物理法：如超声、匀浆、加砂研磨、高压挤压等,2,）化学法：如,EDTA,、,SDS,等,3,）酶法：如自溶法、外加酶法（纤维素酶、果胶酶、溶菌酶等）,3.,提取：适当溶媒、适当条件、适当提取时间和次数,、溶菌酶处理（分解肽聚糖）或用表面活性剂处理。,2024/11/19,34,一、提取1.选材：新鲜、富含目的蛋白且来源方便2023/10,二、分离纯化,从组织细胞中提取的蛋白质溶液，含有许多不同分子量的蛋白质，要获取目的蛋白，须进一步分离纯化，将目的蛋白质与其它蛋白质分开。,分离原理及原则：利用欲分离蛋白质的溶解度、分子大小、电荷、吸附性质、对配体分子的特殊的亲和力。从混杂蛋白质中分离出一个特殊蛋白质。,2024/11/19,35,二、分离纯化 从组织细胞中提取的蛋白质溶液，含有许多不同分,基本步骤,选材,组织细胞破碎：机械法、物理法、化学法、酶法。,提取：选用适当的溶剂,分离纯化：根据等分离蛋白质的特异理化性质设计分离纯化方法。,结晶：结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化。,鉴定、分析：纯度、含量、相对分子质量等。,2024/11/19,36,基本步骤选材2023/10/836,（一）根据溶解度不同的分离方法,利用各种蛋白质的溶解度差异进行分离。影响蛋白质溶解度的因素有,PH,值、离子强度、溶液的介电常数等，各种蛋白质的溶解度取决于它们的分子结构，如：氨基酸组成、极性和非极性基团的多少等。,2024/11/19,37,（一）根据溶解度不同的分离方法 利用各种蛋白质的溶解度,1.,等电点沉淀,蛋白质在,PI,使溶解度最小，,此方法常与其它分离方法配合使用。,2024/11/19,38,1.等电点沉淀蛋白质在PI使溶解度最小，2023/10/8,2.,盐析,沉淀,不同蛋白质可通过加入不同饱和度的中式盐分别沉淀出来（即分级沉淀）。,常用饱和硫酸铵来沉淀蛋白质。此法可用于工业大规模分离。,2024/11/19,39,2.盐析沉淀不同蛋白质可通过加入不同饱和度的中式盐分别沉淀,3.,低温,有机溶剂,沉淀,利用有机溶剂能降低在,Pro,水中的溶解度，使蛋白质沉淀。,常用的有机溶剂有乙醇、甲醇、丙酮等。在低温下操作，有机溶剂一般需预冷（,-40,），缓慢加入。,2024/11/19,40,3.低温有机溶剂沉淀利用有机溶剂能降低在Pro,温度对蛋白质溶解度的影响：在一定范围内，,040,之间，大部分球状蛋白质随温度升高而溶解度增大（血红蛋白除外，,025,随随温度升高而溶解度降低）；在,4050,以上，大部分蛋白质不稳定，开始变性。所以大多数蛋白质的分离在低温下操作。,2024/11/19,41,温度对蛋白质溶解度的影响：在一定范围内，040之间，大部,（二）根据蛋白质分子大小不同的分离方法,1.,透析,:,是将待提纯的,Pro,溶液在装在半透膜的透析袋里，放入 蒸馏水中进行的，透析液可以进行更换，直至透析袋内无机小分子物质降到最低点为止。,超滤,:,是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子物质通过半透膜。而蛋白质截留在膜上。市场上有各种规格的半透膜出售，可根据目的蛋白的分子量选择不同孔径的膜。,2024/11/19,42,（二）根据蛋白质分子大小不同的分离方法1.透析:是将待提纯的,2.,分子筛层析（凝胶过滤、排阻层析）,又称,凝胶过滤,、分子排阻层析，它是根据分子量大小分离混合物最有效的方法之一。,凝胶过滤所用的介质是凝胶珠，内部是多孔的网状结构。凝胶的胶联度或孔度（网孔大小）决定凝胶的分级范围，即能被该凝胶分离开来的,Pro,混合物的分子量范围。,2024/11/19,43,2.分子筛层析（凝胶过滤、排阻层析）又称凝胶过滤、分子排阻层,3.,密度梯度离心,每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，在离心管中被分离成各自独立的区带。,常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度等。,密度梯度在管内分布是管底的密度大，向上逐渐减少，待分离混合物平铺在梯度的顶端，离心采用水平转头高速进行,。,2024/11/19,44,3.密度梯度离心每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度,（三）根据蛋白质带电性的分离方法,在一定,PH,下，不同蛋白质所带的电荷数量和性质不同。,2024/11/19,45,（三）根据蛋白质带电性的分离方法在一定PH下，不同蛋白质所带,1.,电泳,在外电场作用下，带电颗粒向与其电性相反的电极移动。带电颗粒在电场中的泳动速度取决于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。,常用电泳的方法有：,1,）醋酸纤维薄膜电泳：,2,）聚丙烯酰胺凝胶电泳,3,）等电点聚焦电泳：、,4,）免疫电泳：、,2024/11/19,46,1.电泳在外电场作用下，带电颗粒向与其电性相反的电极移动。,2.离子交换层析,指一个溶液中的某一种离子与另一种具有相同电荷的离子相互调换位置，即溶液中的离子跑到固体上，把固体上的离子替换下来。这里的溶液称流动相，固体称固定相。,在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷的静电吸引，,常用交换剂：离子交换纤维素、离子交换凝胶和离子交换树脂。,2024/11/19,47,2.离子交换层析指一个溶液中的某一种离子与另一种具有相同电荷,（四）根据配体,特异性的分离方法,利用蛋白质等高分子化合物能和某些相些相对应的特异分子可逆结合的特性,通过亲和层析法将不同的蛋白质分开。,通常把特异分子称为配基，它能被大分子物质识别并与之结合，如抗原,抗体、酶与底物、激素与受体蛋白质等。,2024/11/19,48,（四）根据配体特异性的分离方法利用蛋白质等高分子化合物能和某,亲和层析,是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力,也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。,亲和层析的原理：先将待提纯的某一,Pro,的配基通过适当的化学反应共价的连接到类似琼脂糖凝胶这类载体表面的功能基团上，一般在配基与多糖基质上接入一段连接臂，使配基与凝胶之间保持足够的距离，不致于因载体表面的空间而阻碍待分离分子与配基的结合。,2024/11/19,49,亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力2023/,三、鉴定,1,、层析法：用层析法检测样品，若是纯的蛋白质，应是单一的洗脱峰。,2,、电泳法：纯的蛋白质它稳定的范围内，在一系列不同,PH,条件下进行电泳时都以单一的泳动速度移动，在电泳图谱上只有一个峰。,3,、免疫化学法：根据抗原与抗体反应的特异性，用已知抗体检查抗原或已知抗原检查抗体。,上述测定方法仅是从一个方面反映蛋白质纯度，具一定局限性，所以对某一种蛋白质纯度的鉴定，必须采用多种方法，综合分析判断。,2024/11/19,50,三、鉴定1、层析法：用层析法检测样品，若是纯的蛋白质，应是单,