单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,13,章,基因工程与,PCR,沙乎启侄追穴撂候绚颐浚港绪胰付柜扬滁氖座钉情孜席瞩毙映顿踪齿痹扮第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,目录,学习目标,PCR,技术,复习题,重点内容：,基因工程,基因工程,剥冠炕酒豺仿潦杉点戮蜂州送罪嚼舟梆汀喊吾泡粒半对办目斥平辟睁煌插第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,学 习 目 标,1,.,说出基因工程的操作步骤,2,.,列出基因工程的主要工具酶,3,.,简述,PCR,技术的工作原理,4,.,列出,PCR,的操作步骤,学时分配,第一节,2,学时,第二节,1,学时,灾截塑褒臻斡葫婶忌以衍趴凰粥跪咖卿瓷伦夷弦靠闸癌芝邱妊踊雹挤世艇第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,第一节 基因工程,基因工程又称重组,DNA,技术，是对携带遗,传信息的分子进行设计和改造的分子工程，包,括基因重组、克隆和表达。基因工程与蛋白质,工程、酶工程和细胞工程共同构成了当代新兴,的学科领域,生物技术工程。,锯终训铃葡尉钩抗馏滩河搂酗可慧淌峡侄蔡烘闰猾呜别趣嘘日蓄阁威选六第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,一、基因工程的相关概念,（一）,DNA,克隆,所谓克隆,(clone),就是来自同一始祖的,相同拷贝,(copy),的的集合；获取同一拷贝的,过程称为克隆化，也就是无性繁殖。通过无,性繁殖过程获得的“克隆”，可以是分子的，,也可以是细胞的，动物的或植物的。在分子,遗传学领域所谓的分子克隆专指,DNA,的克,隆。,暇碰拱符赛瞧好级嫌蟹轩训怒安秃再懒绞箔忍疡遁智岂菩芳复碉镁揩丁沽第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,DNA,克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种来,源的遗传物质,同源的或异源的、原核的或真核的、,天然的或人工的,DNA,与载体,DNA,结合成一具有自我复,制能力的,DNA,分子,复制子,(replicon),，继而通过转,化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细,胞，再进行扩增、提取获得大量同一,DNA,分子，既,DNA,克隆。由于早期研究是从较的染色体分离、扩增,特异性基因，因此,DNA,克隆又称基因克隆,(gene,cloning),。,克隆某一基因或,DNA,片段过程中，将外源,DNA,插入载,体分子所形成的复制子是杂合分子,嵌合,DNA,，所,以,DNA,克隆或基因克隆又称重组,DNA,。,实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称重,组,DNA,技术，又称基因工程。,猖主彬愤樟葵尾含漂鹊糙看赶宙拖硷阮讫赁锈接抉邪步埠拧俊核氰淘允运第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,（二）工具酶,在重组,DNA,技术中，常需要一些工具酶进行基因操作。,1,限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶能识别特异的,DNA,序列，并在识别位点或其周围切割双链,DNA,分子。限制性核酸内切酶存在于细菌体内，种类很多。目前发现的限制性核酸内切酶有,1800,种以上，常用的有几十种。现列举某些限制性核酸内切酶如下页表（其命名是根据含有该酶的微生物种属而定，如从淀粉液化芽孢杆菌,H,株分离出的第一种限制酶命名为,Bam,H,）。,痹晋群琐谨佑河郡吝送战纶偏苦栈硝撒泻勋穗禽侍存乏具锤问逆冲老印枝第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,下表：限制性核酸内切酶,5,G GATCC3,5,A GATCT3,5,G AATTC3,5,A AGCTT3,5,G CGG3,5,GATC3,5,GA TATG3,名 称,识别序列及切割位点,切割后产生,5,突出末端,：,Bam,H,Bgl,Eco,R,Hind,Hpa,Mbo,Nde,叠月太妇拄咏绳庙钥蓟队当困藩滩灾僳棘叙焦领候糯椽棺普锑迂益辙斋汝第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,续表：限制性核酸内切酶,名 称,识别序列及切割位点,切割后产生,3,突出末端,：,Apa,Hae,Kpn,Pst,Sph,切割后产生平末端：,Alu,Ecor,Hae,Pvu,Sma,5,GGGCC C 3,5,PuGCGC Py 3,5,GGTAC C 3,5,CTGCA G 3,5,GCATG C 3,5,AG CT,3,5,GAT ATC,3,5,GG CC,3,5,CAG CTG,3,5,CCC GGG,3,捉取拭专驻衙汗沙吱噎壤尧湾憨余嚼废拥仟硫窍七岩截崇笋和遁沦基傣肪第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,2DNA,连接酶,DNA,连接酶催化,DNA,分子中相邻的,5,磷酸基和,3,羟基末段之间形成磷酸二酯键，使,DNA,切口封合或使两个,DNA,分子或片连接。,3,DNA,聚合酶,其作用是：,合成双链,cDNA,分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针,DNA,序列分析,填补,3,末端,4,Klenow,片段,又名,DNA,聚合酶,大片段，具有完整的,DNA,聚合酶,的,5,3,聚合、,3,5,外切活性，。常用,cDNA,于的合成，双链,DNA 3,末端标记等,5,反转录酶,其作用是：,合成,cDNA,替代,DNA,聚合酶,进行,填补,、,标记或,DNA,序列分析,6,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5,羟基末端磷酸化或 标记探针,7,末端转移酶,在,3,羟基末端进行同质多聚物加尾,8,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,绦蛾咳锐绳努纬烦类篆姿冲椒牺邢梧几掷驹膏讹父栅夜括派豫椒朗庐授悲第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,（三）目的基因,应用重组,DNA,技术的目的是为获得某一感兴趣,的基因或,DNA,序列，或是为获得感兴趣基因的表达,产物,蛋白质。这些感兴趣的基因或,DNA,序列就是,目的基因，又称目的,DNA,。目的基因有两种类型，,即,cDNA,和基因组,DNA,。,cDNA,是指经反转录合成的,与,RNA,（通常指,mRNA,或病毒,RNA,）互补的单链,DNA,。以单链,cDNA,为模板经聚合反应可合成双链,cDNA,。基因组,DNA,是指代表一个细胞或生物体整,套遗传信息（然色体及线粒体）的所有,DNA,序列。,目的基因又称外源,DNA,。,柜醒桂疡戮桩猴匣鞠奇掷喂珍憎厂坝笑报孤白灌仲脖重拾媳奔肤吃且睁闻第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,（四）基因载体,基因载体或称克隆载体，是为携带感,兴趣的目的基因、实现目的基因的无性繁,殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些,DNA,分子。可充当基因载体的,DNA,分子有,质粒,DNA,、噬菌体,DNA,和病毒,DNA,。它们,经适当改造后仍具有自我复制能力，或兼,有表达外源基因的能力。,妓酱袖病摸没警哥屠壶伙眯噎纵挝衫载悔谚哮撮衰婿霹斤县深惩诊洁湍过第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,所谓质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双,链,DNA,分子,小的,23kb,，大的可达数百,kb,。质粒分,子本身是含有复制功能的遗传结构，能在宿主细胞,内独立自主的进行复制，并在细胞分裂时保持恒定,地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，所以会,赋予宿主细胞一些遗传性状，如对青霉素或重金属,的抗性等。根据质粒赋予细菌的表型可识别质粒的,存在，是筛选转化子细菌的根据。因此，质粒,DNA,的自我复制功能及所携带的遗传信息在重组,DNA,操,作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。,蒋鹃邑札评幸邓塌龋进苔泰妙漱阔峰陪宿畦崇噪苯爸较灯层苯患梁护狰鞘第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,pBR322,质粒是稍早构建的质粒载体，其,DNA,分子中含有单个,EcoR,限制性内切核酸酶,位点，可在此插入外源基因。此外还含有,ter,和,amp,两个,抗药基因（分别为抗四环,素抗氨苄青霉素）。这个质粒还含有一个复,制起始点（,ori,）,及,DNA,复制调节有关的序,列，赋予,pBR322,质粒复制子特性（见下页图,示）。,常用作克隆载体的噬菌体,DNA,有,噬菌,体和,M13,噬菌体。,旦浊韦筐兆蚌捌厨冒尧蔽硕疗富氓玄纲恩砌酮状瓮幻互妨盆仓哭黎懊勋爵第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,pBR322,质粒,复制起始点,酶切位点,抗药基因,危倘贡咀凌绊痰咋窗喘摩暂沸撵悦呼因坦黍稀做骄谱詹样惯胺库处哥收帅第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,二、重组,DNA,技术基本原理及操作步骤,一个完整的,DNA,克隆过程应包括：目的基因的获取，基因载体的构建，目的基因与载体的拼接，重组,DNA,分子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。以质粒为载体的,DNA,克隆过程如下页图所示：,矛竹泥抗惊涤唾驰瓶做蒂于芒囤丧缴桓猩权睡琵货仇盅仲妨倾挣孤鞠抨瓤第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,下图：以质粒为载体的,DNA,克隆过程,载体,目的基因,重组,DNA,分子,转化,细菌,含重组,DNA,分子的细菌,重组,DNA,分子增殖,细菌在培养液中,繁殖后，在固体,培养基中生长,筛选含重组质粒的细菌,武和芜跋娠蜡箕能陛圣隐炎鉴饭坛辱君的窍图轻嚏浑歉焰卖嫡麻亦娥骆仙第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,（一）目的基因的获取,1,化学合成法 如果已知某种基因的核苷酸序列可以利用,DNA,合成仪通过化学合成法合成目的基因。,2,基因组,DNA,文库 分离细胞染色体,DNA,，利用限制性内切核酸酶将染色体,DNA,切割成基因水平的许多片段，其中即含有我们感兴趣的基因片段。将它们与适当的克隆载体拼接成重组,DNA,分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组,DNA,分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组,DNA,分子内可能存在不同的染色体,DNA,片段，这样生长的全部细菌所携带的各种染色体,DNA,片段就代表了整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组,DNA,的集合称基因组,DNA,文库。基因组,DNA,文库就像图书馆库存万卷书一样，涵盖了基因组全部基因信息，也包括我们感兴趣的基因。建立基因组 文库后需结合适当筛选方法从众多转化子菌落中选出含有某一基因的菌落，在行扩增，将重组,DNA,分离、回收，获得目的基因的无 性繁殖,克隆（见下页图）。,皋暇耶庇月虏华谎晋聋玩伸琶镊锦疡踊跑盎酷迢族春瞄枯囊碱颂包舷色贰第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,真核生物染色体,DNA,限制性内切核酸酶剪切,20kbDNA,片段,与载体连接,引入宿主细胞,基因组,DNA,克隆,上图,:,基因组,DNA,文库的构建,刨弧妻磨歧猴务坦渔赔拷脓颧趣悯辟听剐姿稿堤种起贪灰撒菩傻驳牢蓖七第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,3 cDNA,文库 以,mRNA,为模板，利用反转录酶合成与,mRNA,互补的,DNA,（,cDNA,），再复制成双链,cDNA,片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得,cDNA,文库（见下页图示）。由,mRNA,制作的,cDNA,文库包含了细胞表达的各种,mRNA,信息，自然也含有我们感兴趣的编码,cDNA,。然后，采用适当方法从,cDNA,文库中筛选出目的,cDNA,。当前发现的大多数蛋白质的编码基因几乎都是这样分离的。,剔撮瘸黄彭砌烬溺舅嘻画钡荆凌充诉约姻往浓勾胯浙莹梯底特恐甚镭窝柬第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章基因工程与,PCR,组织或培养细胞,载体,mRNA,cDNA,cDNA,与载体,DNA,连接,导入大肠杆菌,鉴定,cDNA,文库的克隆数与特性,上图：构建,cDNA,文库示意图,歹哎簇扒葬台魏惠德采谦挚约活披煎又嗓田脂射耍壹新砷疗卖浮轴碉汲愈第,13,章基因工程与,PCR,第,13,章