单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,生物学抗体免疫技术,生物学抗体免疫技术,第1页,生物技术,-,免疫学技术,基础概念,抗原（antigen）：,进入动物体内能刺激动物免疫系统发生免疫应答，从而引发动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应物质,分完全抗原和半抗原,抗体(antibody)：,抗原刺激动物免疫系统，由免疫系统产生分泌能和对应抗原发生特异性结合免疫球蛋白,第三章,生物学抗体免疫技术,第2页,免疫学技术,基础概念,抗原制备：颗粒抗原、半抗原、人工抗原,抗体制备：多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体,第三章,生物学抗体免疫技术,第3页,免疫学技术,-,抗原抗体反应,可反抗原或抗体进行定性、定量、定位检测,抗体抗原以非共价键结合,不可见反应：几秒-几分钟,可见反应：数分钟（小时、日）,影响原因,电解质,温度,酸碱度,第三章,生物学抗体免疫技术,第4页,免疫学技术,酶联免疫法,放射免疫法,荧光免疫法,其它,第三章,生物学抗体免疫技术,第5页,酶联免疫法（enzyme immunoassay),以酶标识抗体或抗原进行抗体抗原反应,酶结合物应含有双功效：,高度特异免疫反应、生物催化放大作用,基础方法,间接法,双抗体夹心法,竞争法,生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）,一些新进展,生物学抗体免疫技术,第6页,酶联免疫吸附,（enzyme linked immunosorbent assay）,间接法,1、将已知可溶性抗原吸附于载体,2、温育后清洗,3、加入可能含特异性抗体待检液,4、温育后清洗,5、加入酶标识二抗,6、温育后清洗,7、加入酶作用底物,8、测定反应颜色深浅,生物学抗体免疫技术,第7页,双抗体夹心法,1、将已知抗体吸附于载体上,2、温育后清洗,3、加入可能含特异性抗原待检液,4、温育后清洗,5、加入酶标识特异性抗体,6、温育后清洗,7、加入酶作用底物,8、测定颜色反应深浅,酶联免疫吸附,（enzyme linked immunosorbent assay）,生物学抗体免疫技术,第8页,竞争法,1、将已知抗体吸附于载体上,2、温育后清洗,3、加入可能含特异性抗原待检液和酶标识已知抗原液,4、温育后清洗,5、加入酶作用底物,6、测定颜色反应深浅,酶联免疫吸附,（enzyme linked immunosorbent assay）,生物学抗体免疫技术,第9页,生物素-亲和素系统（biotin-avidin system）,基础概念,生物素：是一个维生素H，经活化后，可与抗体、抗原、酶以多 配一方式共价结合，且不影响它们活性,亲和素：从卵蛋白中提取一个碱性糖蛋白，可与酶偶合，以1配多方式对生物素有很强亲和力,BAS用于检测基础方法：,BAB法或BRAB法,BA法,ABC法,酶联免疫吸附,（enzyme linked immunosorbent assay）,生物学抗体免疫技术,第10页,酶联免疫吸附,（enzyme linked immunosorbent assay）,生物学抗体免疫技术,第11页,均相酶免疫测定法,无需,“,固定在载体上,”,；无需,“,温育后清洗,”,斑点免疫结合试验,以微孔薄膜为载体，酶免疫反应阳性结果在膜上出现色斑点,胶体金标识较酶标识更为简便,酶联免疫吸附,（enzyme linked immunosorbent assay）,生物学抗体免疫技术,第12页,猪肉和尿液盐酸克伦特罗,免疫胶体金法快速检测,生物学抗体免疫技术,第13页,瘦肉精中毒事件,以来，内地相继发生18起瘦肉精中毒事件，中毒人数达1700多人，死亡1人（不包含上海集体中毒事件）,瘦肉精残留及危害不容忽略，瘦肉精替换品暗潮涌动,上海9.13瘦肉精食物中毒事件（）,生物学抗体免疫技术,第14页,“,瘦肉精,”,学名为盐酸克伦特罗，医学上又称克喘素，常见于治疗哮喘。,因为盐酸克伦特罗添加于饲料饲喂动物后可显著促进动物生长,提升,瘦肉率,所以养殖户称其为,“,瘦肉精,”,，曾在我国外广泛用于动物喂养,生猪食用瘦肉精后皮毛光亮，呼吸急促，个别会出现腿抽搐，站不,稳，爬坡困难；宰后猪肌肉尤其鲜红，后臀肌肉饱满，肥肉非常薄,瘦肉精介绍,生物学抗体免疫技术,第15页,瘦肉精介绍,“瘦肉精”化学性质尤其稳定，加热到170时才能被分解，故普通家庭厨房加热不能将其分解破坏,食用后在胃肠道吸收快，作用维持时间持久。中毒后主要症状表现为头疼、头晕、心悸、心慌、面色潮红、四肢发抖等症状,违法者使用该物质以提升猪瘦肉率和颜色鲜艳程度，不知情市民 错误地认为这么肉才是“好肉”而尤其喜欢选购,生物学抗体免疫技术,第16页,食品卫生法,食品添加剂卫生管理方法（GB2760）,动物性食品中兽药残留最高限量（农业部公告第235号，,12月24日）要求：禁用药品，动物性食品中不得检出：,瘦肉精、沙丁胺醇、西马特罗等31种,违法者法律责任：民事赔偿、行政处罚、刑事处罚,法律要求,生物学抗体免疫技术,第17页,盐酸克伦特罗残留检测方法,动物性食品中克伦特罗残留量测定（GB5009.192-）,第一法：气相色谱质谱法，检出限：0.5ppb,第二法：高效液相色谱法，检出限：0.5ppb,第三法：酶联免疫法（ELISA筛选法），检出限：0.5ppb,动物组织中盐酸克伦特罗测定气相色谱/质谱法,（NY/T 468），检出限：2.0ppb,动物尿液中盐酸克伦特罗测定气相色谱/质谱法,（NY/XQ 421），检出限：1.0ppb,尿液中盐酸克仑特罗测定胶体金免疫层析法,（NY/T933-），检出限：3.0ppb,生物学抗体免疫技术,第18页,猪肉全程监控中瘦肉精检测方法选择,生猪喂养,屠宰场,大型批发市场,零售市场,饲料检测,猪尿检测,猪尿检测,猪肉检测,猪肉,检测,猪肉,检测,酶联免疫法,免疫胶体金,免疫胶体金,酶联免疫法,免疫胶体金,筛检阳性,GC-MS确认,大型仪器确认,政府部门,监督抽检,GC-MS,餐饮业,猪肉,检测,免疫胶体金,销毁和溯源,阳性,GC-MS确认,大型仪器确认,阳性,生物学抗体免疫技术,第19页,免疫胶体金快速检测板外观图,生物学抗体免疫技术,第20页,免疫胶体金快速检测板(试剂)结构图,生物学抗体免疫技术,第21页,检测原理,盐酸克伦特罗快速检测试剂板中央膜面上固定有两条隐形线，克伦特罗抗原固定在测试区作为检测线（T线），二抗固定在质控区作为对照线（C线）。,当待检样品溶液滴入试剂板加样孔后，样品溶液因层析作用往上扩散。假如样品溶液含有对应药品残留，药品将和胶体金颗粒上抗体先行反应，所以当胶体金颗粒随样品溶液扩散至T线时，胶体金颗粒上抗体活性位点将因被样品溶液中药品占据而无法与T线上药品抗原结合；所以当样品中盐酸克伦特罗含量1ppb(检测限)以上时，试剂板上T线将较C线显色淡或甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中盐酸克伦特罗含量在1ppb以下或无残留时，试剂板上T线显色与C线相近或偏深，判定为阴性,生物学抗体免疫技术,第22页,灵敏度,肉样或组织样：1ppb(标准前处理)或5ppb（简单前处理）,尿样：1ppb(标准前处理),特异性：与沙丁胺醇等苯乙胺类药品没有交叉反应；,准确性：与瘦肉精ELISA试剂盒检测结果符合率90,使用期：六个月（冷藏闭光保留）,胶体金免疫层析法检测瘦肉精技术指标,生物学抗体免疫技术,第23页,操作步骤,于5ml离心管中加入5g左右剪碎或是高速匀,浆过猪肉组织样，盖紧管盖,1,将装有样品离心管在90以上水浴锅中加热10 分钟,加热完成后取出冷却至室温；能够显著看,到底部有溶液渗出,3,2,吸收3滴（约100ul）煮出样品渗出液到1.5ml离心管中,4,生物学抗体免疫技术,第24页,操作步骤,吸收3滴（约100ul）盐酸克伦特罗组织样专用稀释液到1.5ml离心管中。充分混合均匀,从包装铝箔袋中取出检测卡平放。吸收3滴（约100ul）混匀溶液加入到试剂板加样孔中,5,6,7,样液滴入加样孔后开始计时，510分钟左右判定结果,生物学抗体免疫技术,第25页,