单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,跳转到第一页,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二讲 固定化酶和固定化菌体,第一节 微生物酶,第二节 酶的特性,第三节 固定化酶,第四节 固定化菌体,第二讲 固定化酶和固定化菌体 第一节 微生物酶,1,第一节 微生物酶,一 生物催化剂酶,二 微生物酶的优越性,三 菌体内酶与菌体外酶,本节内容,：,第一节 微生物酶一 生物催化剂酶本节内容：,2,一 生物催化剂酶,微生物酶,：微生物生活细胞产生的具有催化作,用和专一激活能力的蛋白质。,在常温、常压下对复杂的生物化学反应,有特异的催化作用。在物理化学条件下,不稳定。可通过改变物理、化学条件控,制酶的反应。,在发酵过程中就是利用微生物的酶系统调节代谢和控制生产。,一 生物催化剂酶 微生物酶：微生物生活细胞产生的具有催化,3,二 微生物酶的优越性,1 酶的来源：动物、植物、微生物。,（1）微生物生长速度快，易于大量培养。,（2）通过菌种选育改进培养条件，便于人为提高产量。,（3）菌种不同，产生酶的种类有差异。,（4）利用微生物酶反应，以活菌体进行催化，简化工艺，缩短反应周期。,（5）产量高、成本低、不受季节限制，便于工业化生产。,2 微生物酶的优越性,二 微生物酶的优越性1 酶的来源：动物、植物、微生物。 （,4,三 菌体内酶与菌体外酶,1 菌体内酶,产生的酶分布在微生物细胞内，又叫,胞内酶,。,胞内酶的使用,：,（1）把酶从菌体细胞内抽提出来。繁杂、易失活,（2）固定化细胞。用一定的方法将微生物菌体固定在载体上制成,固定化菌体,。简单、利用率高、不易失活。,如：,大肠杆菌,产生的,青霉素酰胺酶,的利用。,三 菌体内酶与菌体外酶1 菌体内酶胞内酶的使用：,5,2 菌体外酶,产生的酶分泌到菌体外，又叫,胞外酶,。,胞外酶的使用,：,（1）除去菌体，把含酶的培养滤液直接用于生物催化反应。,（2）把酶抽提出来用一定的方法制成“固定化酶”。,如：,葡萄糖淀粉酶,与,羧甲基纤维素,（,CMC）,离子结合制成的,固定化酶,2 菌体外酶产生的酶分泌到菌体外，又叫胞外酶。胞外酶的,6,第二节 酶的特性,一 酶的催化性,二 酶的专一性,三,影响酶反应速度的因素,第二节 酶的特性一 酶的催化性,7,一 酶的催化性,A+B C+D,酶反应,enzymetic resction,酶,底物,：接收酶催化的化学反应的物质。,A、B,酶的催化性,：,改变底物原子排列并增进反应速度的功能,微生物酶的催化性是在常温、常压下起作用的,一 酶的催化性A+B C+D酶反应enzy,8,二 酶的专一性,绝对专一性,：一定的酶只能作用于一定的底物。酶对底,物有很强的选择性。能从多种复杂的底物,混合物中与特定底物反应。如：脲酶只能,作用于尿素。,相对专一性,：一种酶除能与特定底物作用外，也能与同底,物化学结构相类似的底物起作用。,酶对底物的选择性较低。如：,D,氨基酸氧化,酶能催化多种,D,氨基酸脱氨。,立体异构专一性,：一种酶只能作用于旋光异构体的一种,或顺反异构体的一种。如：,L,乳酸,脱氢酶只能作用于,L,乳酸。反丁烯,二酸酶只能作用于分丁烯二酸。,二 酶的专一性绝对专一性：一定的酶只能作用于一定的底物。酶对,9,三 影响酶反应速度的因素,最适反应温度,：能形成,最大反应速度,的温,度.在适温范围内，随温度,上升，反应速度上升。温,度每增高10，速度提高,12倍,受温度、氢离子浓度、酶浓度、底物浓度等因素影响。,1 温度,微生物体内3060,1,B-,半乳糖苷酶,2 酰化氨基酸水解酶,3 葡萄糖异构酶,三 影响酶反应速度的因素最适反应温度：能形成最大反应速度的温,10,2 氢离子浓度,酶蛋白是两性电解质,。酶活性在特定的电荷状态下发挥。,酸性系统,，越倾向于酸，正电荷越多。,碱性系统,，越倾向于碱，负电荷越多。,酸碱都会降低酶活,甚至失活。,最适,PH,值,：能保持最大,酶活性的,PH,值 约在5,10。中性居,多。,2 氢离子浓度酶蛋白是两性电解质。酶活性在特定的电荷状态下发,11,3 酶浓度对反应速度的影响,底物充足、条件适合，酶反应速度与酶浓度成正比。,4 底物浓度对反应速度的影响,米门公式：,V=,V,最大,S,K,m,+S,V：,反应速度,V,最大,:最大反应速度,Km:,米氏常数,S：,底物浓度,（1） 当,Km=S,时，,V=,（2） S Km,时，,V= V,与,S,成正比。一级反应,（3）,S Km,时，,V=V,最大,V,与,S,无关。 零级反应,V,最大,2,V,最大,S,Km,3 酶浓度对反应速度的影响4 底物浓度对反应速度的影响米门,12,米门公式图示,米门公式图示,13,纵上所述，直接利用微生物酶,（1）,不稳定,。在高温、高压、强酸、强碱下。,（2）,易失活,。即使在最适合的条件下反应。,（3）,回收困难,。用适当方法提取目的产物后，残存酶回,收困难。,（4）,反应速度减慢。,随着反应时间的推移。,（5）,经济上不合算。,一次性反应后不能再次使用。,阻碍了微生物酶的应用和发展。,研制固定化酶和固定化菌体,纵上所述，直接利用微生物酶（1）不稳定。在高温、高压、强,14,第三节 固定化酶,一 固定化酶的源流,二 酶固定化后的性质变化,三 固定化酶的形态和作用模型,四 酶的固定化方法举例,五 制备和应用固定化酶需注意的几个方面,第三节 固定化酶一 固定化酶的源流,15,固定化酶,immobilized enzyme,是,1971年,在美国举行的第一次世界酶会议上推荐确定的。又称,水不溶性酶、固相酶。,固定化酶,：水溶性酶通过物理和化学的方法，使之与不溶性载体结合形成的一种不再溶解的酶。,50年代开始。将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，再与羧,肽酸、淀粉酶等结合制成最早的固定,化酶,1969年。 用固定化氨基酰化酶拆分,DL-,氨基酸,。第一个工业生产的固定化酶。,固定化酶immobilized enzyme是1971年在美,16,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,固定化技术,水不溶性酶,（固定化酶）,什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体固定化技术水不溶性酶,17,固定化酶,(Immobilized Enzyme,）是,20,世纪,60,年代发展起来的,项新技术,。以往使用的酶绝大多数是水溶性的酶。这些水溶性酶催化结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的进一步发展。,60,年代后，在酶学研究领域内涌现出固定化酶。,它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶柬缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用；过去曾称其为水不溶酶或固相酶。,从,60,年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近年来，不但固定化方法和载体开发有了长足发展，并且已转向它在工业、医药、化学分析、亲和层析、环境保护、能源开发以及理论研究等方面的应用研究。,一 固定化酶的源流,固定化酶(Immobilized Enzyme）是20世纪6,18,固定化酶的优缺点,固定化酶,:,固定化酶的研究已取得大量重要成果发挥着巨大作用，受到人们极大的关注。其重要原因是它和水溶性酶比较具有以下优点：,(1),极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺,.,(2),可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化。,(3),酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。,(4),在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。,(5),较能适应于多酶反应。,(6),酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。,固定化酶的优缺点固定化酶: 固定化酶的研究已取得大量重要成,19,固定化酶也存在一些缺点：,(1),酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。,(2),比较适应水溶性底物和小分子底物。,(3),与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后才能固定化。,固定化酶也存在一些缺点：,20,二 酶固定化后的性质变化,酶固定化后，原有的某些性状会产生一定变化。,1,对底物的特异性,。尤其注意立体结构对催化底物特异性的影响。,2,酶反应最适,PH,值的改变,。酶固定化后，酶蛋白质的电子状态会发生改变，载体表面的电位要受影响。但有规律，可调整固定化方法，获得最适合的反应条件。,3,动力学常数的改变,。米氏常数和最大反应速度会改变,4,酶反应温度的改变,5,增加酶的稳定性,。对热、,PH,值、有机溶媒、蛋白质变性剂、蛋白质分解酶的稳定性增加。,连续化反应稳定性好。,固定化酶的最大好处,二 酶固定化后的性质变化酶固定化后，原有的某些性状会产生一定,21,三 固定化酶的形态和作用模型,1 制备固定化酶的方法,2 固定化酶的形态结构模型,3 固定化酶的作用模型及其反应机理,三 固定化酶的形态和作用模型1 制备固定化酶的方法,22,1 制备固定化酶的方法,化学方法、物理方法、物理与化学结合法三种,。,制备时应注意,：,（1）保护酶蛋白的立体结构不变。,（2）避免不溶性载体与酶的活性中心发生作用,（3）在温和条件下进行，避免高温、高压、强酸碱等,1 制备固定化酶的方法化学方法、物理方法、物理与化学结合法三,23,（1）,化学方法,制备的固定化酶的形态结构模型,1 离子结合法,2 交联法,3 载体结合法,4 架桥法,5 网络结合,6 酶网,共价键结合法,1,2,3,4,5,6,2 固定化酶的形态结构模型,（1）化学方法制备的固定化酶的形态结构模型1 离子结合法共价,24,（2）,物理方法,制备的固定化酶的形态结构模型,1 物理吸附法,2 包埋法,3 微型胶囊法,4 凝胶格子型,5 空心纤维型,6 纤维丝型,1,2,3,4,5,6,（2）物理方法制备的固定化酶的形态结构模型1 物理吸附法12,25,（3）,物理化学结合法,制备的固定化酶的形态结构模型,1 架桥、包埋结合法；2 包埋与离子结合法；3 共价结合包埋法,1,2,3,（3）物理化学结合法制备的固定化酶的形态结构模型1 架桥、包,26,3 固定化酶的作用模型及其反应机理,（1）作用模型,可以连续进行催化反应（适宜的底物浓度、温度、,pH,值）,以,羧甲基纤维素,固定,葡萄糖淀粉酶,水解,淀粉生产葡萄糖,为例说明。,3 固定化酶的作用模型及其反应机理（1）作用模型以羧甲基纤维,27,（2）反应机理,载体的作用,：,保持酶的立体结构,保护酶的活性中心,保证酶的连续催化反应,（2）反应机理载体的作用： 保持酶的立体结构,28,四 酶的固定化方法举例,（,一）,载体结合法制备固定化酶,（二）,包埋法制备固定化酶,（三）,交联法制备固定化酶,（四）,固定化酶的制法及其特性比较,四 酶的固定化方法举例（一） 载体结合法制备固定化酶,29,（一）载体结合法制备固定化酶,1 常用载体,粒子大小、网目结构表面积大小、亲水性部分的量、化学组成等方面考虑。,纤维素、右旋糖酐、葡萄糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃,2 常用方法,按载体结合形式分为：,共价键结合法,离子键结合法,物理吸附法,（一）载体结合法制备固定化酶1 常用载体2 常用方法,30,1.2.3,共价键结合法,共价键结合法是酶蛋白的侧链基团和载休表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法,。其优点是：酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制作手续亦较繁琐。,酶分子和载体连接的功能基团,在实际中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基以及苯环。被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团，否则将导致酶失去活性。,1.2.3 共价键结合法,31,(2),载体的选择,载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是,:,一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定 性上都优于疏水载体。,载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。,载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团。,载休没有或很少有非专一性吸附。,载体来源容易方便并能反复使用。,(2)载体的选择,32,2 常用方法之一,共价键结合法,酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备固定化酶的方法。即，通过,化学共价键,，把与,酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团,连接在不溶于水的,载体,上。,（1）酶与载体反应的主要功能基团,游离羟基：肽链,C,末端的, ,羧基，天门冬酰氨酸,，谷氨酸的,羧基,游离氨基：肽链,N,末端的,氨基，,赖氨酸,氨基,巯基：半胱氨酸,羟基：丝氨酸，苏氨酸,酚基：酪氨酸,咪唑基：组氨酸,2 常用方法之一共价键结合法 酶与不溶于水的载体以,33,2 常用方法之一,共价键结合法,（2）所用载体,重氮化法,：具有氨基的不溶性载体（,RNH,2,）。,以稀盐酸和亚硝酸钠作用形成重氮化合物。,多糖类衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃,烷 化 法,：,卤族的乙酰衍生物,（氯乙酰纤维素、溴乙酰纤,维素、碘乙酰纤维素）,含卤族的高聚物,（氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）,2 常用方法之一共价键结合法（2）所用载体重氮化法：具有,34,2 常用方法之一,共价键结合法,（4）优缺点,优点,：酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长,时间使用。,缺点：,制备条件复杂；酶蛋白活性中心易破坏,2 常用方法之一共价键结合法（4）优缺点优点：酶与载体结,35,1.2.1,吸附法,吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。,(1),物理吸附法,:,通过氢键、疏水作用和,电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上从而制成固定化酶,。常用的载体有：,有机载体。纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。比如用纤维索作为吸附剂，用膨润的玻璃纸或胶棉膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、,6,磷酸葡萄糖脱氢酶。吸,附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约,70mg/cm,2,。,无机载休。氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。比如用多孔硅为载体吸附米曲酶和枯草杆菌的,r,淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在,45,进行固定化，用高浓度的底物进行连续反应半衰期分别为,14,、,35,、,60d,。无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落。,1.2.1 吸附法吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。无,36,(2),离子交换吸附法,:,这是,将酶与含有离予交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。,酶吸附较牢，在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离子交换剂，如二乙基氨基乙基,(DEAE)-,纤维素、混合胺类（,ECTEDLA,）,纤维素、四乙氨基乙基,(TEAE),纤维素、,DEAE,葡聚糖凝胶、,Amberlite IRA93,、,410,、,900,等。阳离子交换剂,基，如羧甲基,(CM),纤维素、纤维素柠檬酸盐、,Amberlite CG50,、,IRC50,、,IR200,、,Dowex50,等。,此外，,DEAE,纤维素吸附的,淀粉酶、,蔗糖酶已作为商品固定化酶。,(2)离子交换吸附法: 这是将酶与含有离予交换基的水不溶载,37,通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷能有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸,。用水溶性乙烯,顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用,DEAE,纤维素和,DEAEScphadex,载体有效的固定。这种固定几乎是不可逆的吸附。此外酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、,pH,、温度、蛋白质浓度及酶和载体的特性相关。,pH,的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧,(1-2pH,单位,),吸附将明显减少，但也有个别例外。盐对吸附的影响较为复杂在一些特殊事例中、盐可以促进蛋白质的吸附。这就是所谓的盐析吸附。,对蛋白质吸附来说，随温度的升高吸附下降。,载体的表面积、多孔性及其顶处理都影响对酶的吸附。,通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷能有效,38,吸附法制备固定化酶操作简单，可充分选择不同电荷、不同形状的载体，吸附过程可以同时纯化酶，固定化酶在使用过程失活后可重新活化，同时，载体可以回收再利用。但由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大，同时由于吸附法制备的固定化酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作为稳定性。,吸附法制备固定化酶操作简单，可充分选择不同电荷、,39,2 常用方法之二,离子键结合法,酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶,（1）所用载体,纤维素的衍生物，离子交换树脂,（2）固定化酶的制备机理,酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固相载体之间由于静电相吸而形成络合物，使酶吸附到离子交换剂上。,（3）优缺点,优点,：操作简便，处理条件温和，酶的高级结构,和活性中心不易破坏，有利于制备高活性,酶,缺点,：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下,酶易从载体上脱落,2 常用方法之二离子键结合法酶与具有离子交换基团的不溶性,40,2 常用方法之三,物理吸附法,（1）常用载体,无机物,有机物,高分子化合物,活性炭、白陶土、,氧化铝、多孔玻璃、,硅胶、碳酸钙凝胶,淀粉麸质、大孔树脂、,DEAE,纤维素、,DEAE,葡聚糖凝胶,（2）固定化酶的制备机理,所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。,（3）优缺点,优点,：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的,高级结构;方法简单，成本低。,缺点,：酶吸附不牢固，易脱落；,防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应,2 常用方法之三物理吸附法（1）常用载体无机物有机物活性,41,物理吸附法固定化酶举例,载体,固定化酶,活性炭, ,淀粉酶、, ,淀粉酶,蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶,多孔玻璃,核糖核酸酶、木瓜蛋白酶,脂肪酶、葡萄糖氧化酶,氧化铝,葡萄糖氧化酶,碳酸钙凝胶,亮氨酸氨肽酶,纤维素,胰蛋白酶、核糖核酸酶,麸素,淀粉液化酶,硅胶,磷酸化酶,物理吸附法固定化酶举例载体固定化酶活性炭 淀粉酶、 ,42,（二） 包埋法制备固定化酶,酶本身不参与反应，仅用物理方法把酶包埋在凝胶细小的格子中，或包围在半透膜或聚合物中。,包埋方法有两种,：,1 格子型固定化酶,2 微型胶囊法,（二） 包埋法制备固定化酶 酶本身不参与反应，仅用物理,43,1 格子型固定化酶,（1）原理,以,丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂,等材料，在酶存在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的网状格子中。反应为厌氧反应。,1 格子型固定化酶（1）原理,44,酶液,丙烯酰胺,N，N,双丙烯酰胺,氢气,催化剂：四甲基乙二胺、明矾胺,引聚剂：,过硫酸钾、核黄素,光照,聚合反应,凝胶酶块,固定化酶,切割,（2）方法（,以丙烯酰胺为材料是最常用的方法,）,酶液丙烯酰胺N，N双丙烯酰胺氢气催化剂：四甲基乙二胺、明矾,45,固定化酶及固定化菌体ppt课件,46,凝胶或膜,酶,聚丙烯酰胺凝胶,、,淀粉酶,葡萄糖氧化酶,乳酸脱氢酶,淀粉,胆碱酯酶,琼脂,青霉素酰胺酶,（3）制备的固定化酶,凝胶或膜酶聚丙烯酰胺凝胶、淀粉酶淀粉胆碱酯酶琼脂青霉素,47,2 微型胶囊法,（1）原理,把,酶包在,超薄半透性的,聚合物膜,中，制成球状含酶,微型胶囊,。,2 微型胶囊法（1）原理,48,（2）特点,微囊直径几微米几百微米。,低分子底物,可以自由通过并,进入微囊,内。,与酶反应后的,生成物被排除在微囊外,，,酶本身,是高分子物质不能通过微囊而,被留在微囊中,，,外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内,（2）特点微囊直径几微米几百微米。,49,表面聚合法,以,亲水性单体,和,疏水性单体,在表面发生聚合反应将酶包围起来，形成微型胶囊酶。分,三,步：,常用形成胶囊的材料和生成的聚合物种类,亲水性单体,疏水性单体,生成的聚合物,聚胺,聚异氰衍生物,聚胺、聚酯,乙二醇、多元醇,聚异氰衍生物,聚胺、聚酯,（3）方法,表面聚合法,、液中干燥法、相分离法,表面聚合法以亲水性单体和疏水性单体在表面发生聚合反应将酶包围,50,A,乳化分散,：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不溶于水的有机溶媒中充分乳化。,B,表面聚合,：将含有疏水性单体的有机溶媒加入到上述乳化液中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起来形成微型胶囊球。,三步,：,C,清洗,：反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩余单体,1,A 乳化分散：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不溶于水的有机,51,（4）微型胶囊法形成的固定化酶,胶囊制法,囊膜的素材,应用的酶,表面聚合法,尼龙,乳糖酶,羧基脱氢酶,聚合脲,天门冬酰胺酶,液中干燥法,聚苯乙烯,过氧化氢酶,脂肪酶,脲酶,相分离法,火棉胶,过氧化氢酶,天门冬酰胺酶,硝酸纤维素,天门冬酰胺酶,（4）微型胶囊法形成的固定化酶胶囊制法囊膜的素材应用的酶表面,52,缺点,： 单体很活跃。在胶囊化过程中要充分注意防,治酶的失活和变性。,优点,：,A,制备条件温和，制得的胶囊不易变化。,B,能很好地保存天然酶的活性和特性。,C,大小可任意调节，制备时间短。,（5）微型胶囊法优缺点,缺点： 单体很活跃。在胶囊化过程中要充分注意防优点： A 制,53,（三） 交联法制备固定化酶,概念,：,双功能试剂或多功能试剂,与酶蛋白质中的,氨,基酸残基,作用，使酶与酶之间交联成,网,，,凝集成固定化酶,1 发生作用的氨基酸残基,：,酪氨酸的酚基,胱氨酸的,SH,巯基,N,末端的,a,氨基。,2 常用的双功能或多功能试剂,：,戊二醛,聚甲叉双碘乙酰胺,双重氮联苯胺,（三） 交联法制备固定化酶概念：双功能试剂或多功能试剂与酶蛋,54,3 酶网载体交联法,先将酶吸附在不溶于水的载体上，再用双功能试剂,戊二醛,与,酶蛋白的氨基,之间,交联,起来，形成,酶网,包围在,载体表面。,常用载体,：硅胶、离子交换树脂。,3 酶网载体交联法,55,（四） 固定化酶的制法及其特性比较,特性,制备方法,共价键,结合法,离子,结合法,物理,吸附法,包埋法,制法,难,易,易,难,酶活力,高,高,高,低,底物特异性,易变,不变,不变,不变,结合能力,弱,中,弱,弱,再生,不可,可能,可能,不可,交联法,难,中,易变,强,不可,（四） 固定化酶的制法及其特性比较 特性制备方法共价键离子,56,五 需注意的几个方面问题,（一,）,酶活性的测定方法,（二）,制备过程中保持酶活性稳定的方法,（三）,固定化酶的保存方法,五 需注意的几个方面问题（一）酶活性的测定方法,57,（一）酶活性的测定方法,1 测定酶的固定化量,固定化反应完成后，以原始酶量减去洗涤液（反应液）,中残存的酶含量。,2 测定颗粒直径,固定化酶的粒径越小，酶活性越高。,固定化酶颗粒直径,大小影响酶活性。,3 测定酶反应最适,pH,值,酶固定化后反应的最适,pH,较原来的酶有所变化。,4 检查酶是否脱落,测定酶活性后，滤除固定化酶，用离心所得的溶液再经,过适当保温检查是否还继续进行反应，,如果溶液中出现酶,反应，说明酶脱落。,（一）酶活性的测定方法1 测定酶的固定化量,58,（二）制备过程中保持酶活性稳定的方法,1,包埋法、聚丙烯酰胺凝胶法或微型胶囊法时，固定化,反应时，,预先用与酶有特异亲和力的底物等，保护酶,的活性中心,，而后再进行固定化反应。,2,以酶的前体状态进行固定化,，然后经过活化制备固定,化酶。,3,防止酶在催化反应中活性下降,下降原因,（1）,酶的变性,（2）,吸附了酶的抑制物质。,（3）,被微生物污染,（4）,酶脱落,（5）,载体崩溃或变形分解,（6）,操作失误,（二）制备过程中保持酶活性稳定的方法1 包埋法、聚丙烯酰胺凝,59,（三）固定化酶的保存方法,使用时固定化酶的保存是一个很重要的环节。,1,真空冷冻干燥保存（长期保存）,2,低温保存,3,多孔玻璃的无机质载体比纤维素等的有机质载体,更适于长期保存。,4,无机质载体中，以重氮结合法制备的固定化酶具,有较好的保存性。,（三）固定化酶的保存方法使用时固定化酶的保存是一个很重要的环,60,第四节 固定化菌体,固定化菌体概念,：把菌体细胞中特定的,酶不经过分离提纯,，,直接,用适当的方法,将菌体加以固定,来催化各种特定的生物化学反应。,优点,：不需提制酶，可保持酶的活性。反复使用，成,本低,与固定化酶比较,制备方法,：与固定化酶相同，有,包埋法、载体结合法,、交联法、热处理法、射线处理法,。,其中,包埋法是最理想的方法,。,第四节 固定化菌体固定化菌体概念：把菌体细胞中特定的,61,固定化细胞 固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的。它的优点如下,:,(1),省去了酶的分离手续为多酶系统，无须辅因子再生。,(2),细胞生长快、而且多、反应快。,(3),可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边徘出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。,(4),保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对污染因子的抵抗力增加。,固定化细胞 固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的。它的,62,固定化细胞同时也存在些缺点：,(1)必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。,(2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成。,(3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。,固定化细胞同时也存在些缺点：,63,一 包埋法,1 原理,在菌体细胞本身不发生化学反应的情况下，将其,包进,半透性的多聚物膜,内。,小分子的底物和产物均可,自由出入,，而,菌体细胞却不会漏出,。,2 方法,常用的包埋材料,是：,聚丙烯酰胺凝胶、明胶、琼脂,以制备含天门冬氨酸的大肠杆菌细胞为例,将菌体细胞预先用生理盐水悬浮，向悬浮液中加入聚丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，然后加入催化剂过硫酸胺和加速剂四甲基乙二胺，混匀后放置一定时间聚合。将得到的凝胶破碎即得到固定化细胞。收率达72.5,一 包埋法1 原理2 方法常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝胶、,64,二 载体结合法（吸附法）,1 原理,微生物细胞表面带有,电荷,，在适当的条件下可以,与载体的,离子交换基团,形成络合物,或,吸附在载体,上。,2 常用载体,离子交换纤维素。阴离子树脂、,DEAE,纤维素。,3 优缺点,优点,：方法简单、载体易于再生。,缺点,：结合力弱，菌体细胞易脱落。,二 载体结合法（吸附法）1 原理2 常用载体离子交换纤维素。,65,动植物细胞固定化,植物细胞固定化,植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。,80,年代开始研究，目前一般采用吸附法和包埋法。,动植物细胞固定化植物细胞固定化 植物细胞比菌体细胞娇,66,吸附法,吸附法是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内。或吸附于中空纤维外壁上。如将植物细胞定置在中空纤维的外壁与容器内壁之间，培养液及,O,2,在中空维管内流动，透过中空纤维管壁,(,具半透膜性,),，传递给附着于外壁的细胞，细胞代谢产物亦透过外壁随管内培养液流出。利用此法固定的豌豆细胞和胡萝卜细胞进行生产多酚化合物的研究，可连续使用,1,个多月。又如将洗净、灭茵后的泡沫塑料放进辣椒细胞培养液中，振荡培养一 段时间，细胞吸附于塑料孔洞内，并能生长繁殖。,包埋法,包埋法是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉菜胶等多孔凝胶中。,Brodelius,等,(1979),首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花细胞、毛地黄细胞、海巴戟细胞。,吸附法,67,动物细胞固定化,动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩需要最温和的固定化方法。目前,动物细胞固定的方法有吸附法和包埋法两种，其中吸附法用的最多。,吸附法 由于大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中趋向于附着固体表面。因此，吸附法特别适合于制备固定化动物细胞。主要载体及固定方法有：,(1),转瓶法。转瓶是由玻璃或塑料制成。其表面经一定处理而带有电荷，如用高锰酸钾等氧化剂，强酸、强碱或紫外辐射等表而处理，可使动物细胞附着于表面，转瓶以一定旋转速度进行培养,.,若在转瓶内增大表面积，可提高生产能力。,(2),微载体法。微载体是指直径为,100200um,，相对密度接近于,1.0,的颗粒固定化载体。它是由表面带有电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成的。微载体具有较大的表面，对细胞生长和物质传递特别有利，但强度不够易破碎，使用时间较短，已用于固定多种细胞。如用于生产,p,干扰素、人纤溶酶原活化剂白细胞介素及各种疫苗的细胞固定化。,动物细胞固定化,68,(3),中空纤维法 中空纤维由聚丙烯、硅化聚碳酸脂等高分子聚合物制成。其管壁具有半透性。将细胞胞置于管外壁扣容器外壳之间，则细胞附着于外壁上，培养液从管内流动，能透过管壁进行质热传递，中空纤维起着体内微血管的作用，有利细胞生长及其新陈代谢。已有多种中空纤维固定化细胞用于生产各种单克降抗体和疫苗等。,包埋法 包埋法根据载体与方法不同，亦有凝胶包埋法和半透膜包埋法两种,.,(1),凝胶包埋法。用于动物细胞固定化的凝胶主要有琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤蛋白等。琼脂糖包埋法是，将,1,一,2.5,的琼脂糖加热溶解后冷至,3738,与一定量动物细胞混合后分布于石蜡油中,.,使温度湖,37,降至,10,左右，可得到直径为,0.10.3mm,的微球状固定化细胞，用于单克隆抗体、白细胞介素等的生产。,(3)中空纤维法 中空纤维由聚丙烯、硅化聚碳酸脂等高分子聚,69,海藻酸钙凝胶包埋法是，将动物细胞与一定浓度的海藻酸凝胶溶液混合均匀后，用注射器将混合液滴到一定,CaCl,2,溶液中即成。,血纤蛋白包埋法是将动物细胞与血纤蛋白混合后加入凝血酶而固定化。,(2),半透膜包埋法。利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋形成微囊形固定化动物细胞。例如：先用海藻酸钙包埋动物细胞制成胶粒后，再在外面包一层聚,Lys,膜，然后放入柠檬酸钠溶液中去除海藻酸钙，便可获得由多聚,Lys,包埋的动物细胞。,海藻酸钙凝胶包埋法是，将动物细胞与一定浓度的海藻酸凝胶溶液混,70,3.3,原生质体固定化,原生质体固定化，首先要制备较稳定的原生质体，然后用凝胶进行包埋。,（,1,）琼脂多孔醋酸纤维固定法 用生理盐水配制,3,一,4,的琼脂，加热，溶解，灭菌后冷至,50,左右，勺等体积一定浓度的原生质体混合，将混合液滴加于多孔醋酸纤维上，置冰箱冷却凝固。,（,2,）海藻酸钙凝胶固定法 以,3,一,6,海藻酸钙溶液与等体积,定浓度的原生质体混合，混合液滴入,CaCl2,溶液中，并浸泡,12h,。即成。,（,3,）角叉莱胶固定法 配制,1,一,8,角叉菜胶加热溶解，灭菌后，冷却至,50,左右，与等体积原生质体混合，混合液滴入一定浓度的预冷,KCl,中，即得球状固定化原生质体。,（,4,）光交联树脂固定法 配制,30,一,60,浓度的光交联树脂预聚体加热溶解后，在,50,左右加人,1,光敏刘与等体积的原生质体混合后，摊成薄层经紫外光照射，聚合后形成小块，制成片状的固定化原生质体。,固定化原生质体用于生产各种氨基酸、酶和生物碱等物质以及甾体转化等。,3.3原生质体固定化,71,包埋法制备固定化菌体应用举例,包埋材料,菌种,酶系,用途,琼脂,大肠杆菌,大肠杆菌,谷氨酸脱羧酶,青霉素酰胺酶,制造,-,酪蛋白,生产6-氨基青霉烷酸(6-,APA),明胶戊二醛,短乳杆菌,链霉菌,葡萄糖异构酶,从葡萄糖生产高果糖浆,聚丙烯酰胺,大肠杆菌,天门冬氨酸酶,醋酸纤维素,大肠杆菌,青霉素酰胺酶（裂解）,青霉素酰胺酶（合成）,生产6,APA,生产半合成青霉素,包埋法制备固定化菌体应用举例包埋材料菌种酶系用途 琼脂大肠杆,72,载体结合法制备固定化菌体举例,载体,菌体,酶,用途,离子交换纤维素,丝状菌孢子,转化酶,蔗糖的转化,阴离子树脂,放线菌,葡萄糖异构酶,制造果糖,DEAE-,纤维素,巨大芽孢杆菌,青霉素酰胺酶,制造6,APA,载体结合法制备固定化菌体举例载体菌体酶用途离子交换纤维素丝状,73,Thank you for your attention !,Thank you for your attention !,74,Antigenic determinant,是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(epitope).,Antigenic determinant是指抗原分子中决定,75,细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团,细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团,76,Polyclonal antibody,PcAb：针对多种抗原决定簇的混合抗体,Monoclonal antibody,McAb:由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体,Polyclonal antibody,PcAb：针对多种抗,77,固定化酶及固定化菌体ppt课件,78,杂交瘤技术的理论基础,淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体,细胞融合,技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性,利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb,杂交瘤技术的理论基础淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克,79,当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。,当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个,80,融合的结果及命运,杂交瘤细胞,未融合的脾细胞,未融合的骨髓瘤细胞,脾-脾杂交细胞,骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞,融合的结果及命运杂交瘤细胞未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞脾,81,杂交瘤技术,通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。,杂交瘤技术 通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建系小,82,免疫动物 培养骨髓瘤细胞,收集致敏的,B,淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞,细胞融合,HAT,选择培养基筛选杂交瘤细胞,检测筛选阳性细胞,克隆化培养（反复3-5次）,获得稳定分泌,McAb,的杂交瘤细胞株,McAb,的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）,McAb,纯化及鉴定,免疫动物,83,融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95,融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞,饲养细胞一般在融合前一天制备,融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高,84,一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。,可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。,一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选,85,克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。,克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次,克隆化方法：,有限稀释法,、软琼脂平板法、显微克隆法,阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染,克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体,86,单抗生产的方法：,动物体内诱生法,：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。,单抗生产的方法：,87,佐剂的概念与种类,概念：与抗原同时或先于抗原进入,机体，以提高抗原的免疫原,性的物质。,种类：非免疫原性物质,免疫原性物质,佐剂的概念与种类概念：与抗原同时或先于抗原进入,88,佐剂的作用机理,延长抗原的作用时间,增强吞噬作用,刺激抗原提呈,促进细胞因子分泌,诱导淋巴细胞分裂、增殖,影响,T,细胞“极化”,佐剂的作用机理延长抗原的作用时间,89,单克隆抗体制备过程,1,、致敏淋巴细胞的准备,2,、骨髓瘤细胞的准备,3,、细胞融合,4,、选择性培养,5,、抗体分泌细胞的筛选,6,、克隆化过程,7,、单克隆抗体的制取,单克隆抗体制备过程1、致敏淋巴细胞的准备,90,抗原,致敏淋巴细胞,骨髓瘤,细胞,融合,选择性,培养,抗体分泌细胞筛选,克隆化,单抗制取,单抗纯化,单抗鉴定,抗原致敏淋巴细胞骨髓瘤 融合选择性抗体分泌细胞筛选克隆化单,91,致敏淋巴细胞,骨髓瘤细胞,离心,1000rpm 10min,50%PEG,1ml,培养液,10ml,离心,1000rpm 7min,37,。,C,摇动、由慢渐快,1min,、静止,1.5min,加入,HAT,培养液悬浮细胞，置于培养孔内,致敏淋巴细胞骨髓瘤细胞离心 1000rpm 10min50%,92,克隆化过程,概念：建立单一细胞克隆,方法：有限稀释法,克隆建立的标准：连续两次以上,100%,阳性孔,饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞,克隆化过程概念：建立单一细胞克隆,93,有限稀释法,计数,10,3,/ml,10,2,/ml,10/ml,0.5-2/,孔,有限稀释法计数103/ml102/ml10/ml0.5-2/,94,单克隆抗体的特性,1,、理化性状高度均一,2,、抗原结合性高度特异,3,、生物活性高度单一,单克隆抗体的特性1、理化性状高度均一,95,纯化抗体的保存,1,、,4,。,C,保存,2,、, 20,。,C,保存,3,、冷冻干燥保存,纯化抗体的保存1、4。C保存,96,