第二专题 活性肽,/,蛋白的分离提取及应用,一、,概述,定义：,活性肽是一类具有特殊生理活性的肽类。,活性蛋白质是一类具有特殊生理活性的蛋白质,分布：,动物、植物及微生物组织；动物乳汁；植物种子等。,一般性质：,两性解离；等电点；胶体性；变性；沉淀；显色。,二、,活性肽及活性蛋白质的类型,常,见,类,型,活性肽,活性蛋白质,1.谷胱甘肽,2.降压肽,3.抗菌肽,4.高F值肽,5.大豆肽,6.乳活性肽,1.乳铁蛋白,2.大豆蛋白,3.花生蛋白,4.谷物蛋白,三、,活性肽及活性蛋白质的一般特性,1.谷胱甘肽（GSH）,（又称长寿因子、抗衰老因子）,结构：,-L-谷氨酰,-,L半胱氨酰-,L甘氨酸,（3肽）,生理作用：,1）自由基清除剂 GSH含有巯基（-SH），可以和有 机过氧化物作用，消除自由基；,2）解毒剂 可用于氟化物、CO、重金属及有 机溶剂的解毒；,3）保护作用 对放射性药物引起的白细胞减少 症状起到保护作用。,4）防止皮肤老化及色素沉着,2.降压肽,降压肽是通过抑制血管紧张素转换酶（ACE）的活性，来体现降压功效。,血管紧张素I,血管紧张素II,ACE,促使末梢血管收缩,血压升高,降压肽,降压肽的来源：,1）乳酸蛋白（12肽）,2）鱼贝类（6肽）,3）植物,大豆降压肽,玉米降压肽,无花果降压肽,优点：这些肽通常是在温和条件下由蛋白酶水解制得，食用安全性高，对血压正常的人物降压作用。,3.抗菌肽,由30多个氨基酸残基组成的碱性寡肽（PI7），水溶性好，具有热稳定性，表现出较强的阳离子特性。,主要功能：,杀菌作用 某些抗菌肽具有广谱抗菌高效杀菌活性，部分对真菌、病毒及癌细胞）。,造成胞内容物溢出,细菌细胞膜,破坏膜完整结构,在膜上形成离子通道,细胞死亡,抗菌肽,4.高F值肽,F（Fischer）值是支链氨基酸(BC)与芳香族氨基 酸（AC）的摩尔比值。,高F值肽主要生理功效：,1）防治肝性脑病,2）改善蛋白质营养状况 在肠道易消化吸收，常用于烧伤、外科手术等患者的蛋白质营养补充；,3）抗疲劳 在应急情况下，BC可直接向肌肉提供能源。可作为高强度工作者和运动员能量补充，消除疲劳、增强体力。,5.大豆肽,是大豆蛋白的酶水解产品，由3-6个氨基酸组成，有较好的流的特性，不易形成沉淀，可用于酸性饮料的制作。,大豆蛋白,大豆肽（3-6个氨基酸）,蛋白酶,主要生理功能：,1）易于消化吸收；,2）促进脂代谢；,3）增强肌肉的运动力、加速肌红细胞的恢复；,4）较低的过敏性。,6.乳活性肽,由乳蛋白经胰蛋白酶作用下水解由5-15个氨基酸残基组成的肽。,乳蛋白,胰蛋白酶,乳活性肽,（5-15个氨基酸残基）,主要作用：,1）促进人体钙磷吸收；,2）降低血压；,3）抗血栓；,4）镇静安神。,1.乳铁蛋白,活性蛋白质,牛乳或母乳中的一种红色含铁的糖蛋白。,Mr 77000-1500，,牛乳铁蛋白pI=8.0,母乳pI=6.0。,生理功效：,1）刺激肠道中铁的吸收；,2）抑菌、抗病毒；,3）调节吞噬细胞功能；,4）调节发炎反应。,2.大豆蛋白,是一类存在大豆的蛋白质。,主要生理功效：,1）营养价值丰富 必需氨基酸比例与人体必需氨基 酸比例接近；,2）降低血清胆固醇；,3）抑制动脉血管硬化；,4）增强免疫效果；,5）抗癌；,6）防止骨质疏松。,3.金属硫蛋白（MT）,是一种含有大量镉、锌、富含半胱氨酸的低分子量蛋白质，Mr6 000-10 000，每摩尔MT有60-61个氨基酸残基，其中有18个半胱氨酸，每3个半胱的巯基结合一个2价的金属离子。,主要生理功效：,1）参与微量元素的储存、运输和代谢；,2）清除自由基，拮抗电离辐射；,3）金属离子的解毒作用；,4）参与细胞DNA的复制和RNA的转录作用，参与蛋白质的合成与分解及能量代谢的调节。,三、一般的活性肽及蛋白质的提取方法,蛋白质具有,的一般特性,两性解离,等电点（pI）,胶体性,变性,沉淀,显色,电泳、离子交换层析,沉淀蛋白质,透析,加热、酸、碱，破坏蛋白质的高级结构,盐析,双缩脲反应 540nm,酚试剂法 650nm,考马斯亮蓝法 595nm,四、活性肽/活性蛋白质的制备流程,1.谷胱甘肽的生产方法,4种,溶剂萃取法,发酵法(主要介绍),酶法,化学合成法,啤酒酵母连续发酵生产谷胱甘肽的工艺流程,发酵基质,啤酒酵母菌,固定化,富含谷胱甘肽液,分离精制,稳定化,喷雾干燥,连续供给,菌种的选择和改良,诱变技术,基因重组技术,固定化载体的选择,等电点沉淀法,树脂吸附,离子交换层析法,防止巯基氧化,碳源、氮源比例,矿物盐的种类,培养条件,2.高F值肽的生产,起始原料 蛋白酶 得率（%）,鱼蛋白 链霉蛋白酶 69.3,胃蛋白酶,大豆蛋白 同上 60.9,乳清蛋白 同上 81.0,玉米醇溶蛋白 嗜碱蛋白酶 56.0,肌动蛋白酶,玉米黄粉 碱性蛋白酶 7.9,木瓜蛋白酶,*肌动蛋白酶 兼有氨肽酶和羧肽酶作用，也能水解芳香族氨基酸形成的肽键。,*碱性蛋白酶 水解芳香族氨基酸形成的肽键。,去除芳香族氨基酸（AC）的方法,为了提高F值，必须从酶水解液中除去A C，常有的方法：,1.离子交换法,2.膜分离法,3.凝胶过滤法,4.高效液相色谱法,5.电泳技术,6.吸附色谱法,选用Sephadex G-15凝胶色谱柱,高支链氨基酸低聚肽在220nm有最大吸收峰；,芳香族氨基酸在280nm有最大吸收峰。,浓缩高F值肽的方法,超滤法,冷冻法,蒸发浓缩法,高F值肽的用途,制成口服液,制成胶囊,添加到食品或饮料中,开发成各种功能性食品,3.降压肽的生产技术,降压肽的生产方式,原料来源 生产方法 多肽序列,蛇毒 提取 Pyr-W-P-R-P-T-P-N-I-P-P,酪蛋白 胰蛋白酶 F-F-V-A-P-F-P-E-V-F-G-K,玉米醇溶蛋白 嗜热菌蛋白酶 V-H-L-P-P-P,金枪鱼肉 嗜热菌蛋白酶 I-V-G-R-P-R-H-Q-G,发酵乳 发酵 I-P-P,*Pyr是焦谷氨酸,4.大豆蛋白的生产工艺,脱脂大豆粉,残渣（纤维等多聚糖）,清夜（蛋白糖）,豆清液,少量可溶性蛋白,（糖、水分）,蛋白凝块,直接干燥,大豆蛋白,五、活性肽/活性蛋白的研究方向,我国活性肽研究进展,我国生物活性肽研究开发起步晚，研究单位少，基础和应用研究都很薄弱，目前处于起步阶段。,我国在生物活性肽的研究开发上，从事活性肽的研究单位也多从医药角度出发，研究力量及投入较少，限制了活性肽药食两用功能的发挥，市场上国产的活性肽药品和食品寥寥无几。但近几年研究逐步活跃起来，报道渐多，前景看好。,活性肽的研究方向,1.肽的定向酶解技术开发,包括高效、专一性高的酶的选育、,复合酶系共同作用机理。,2.脱苦微生物的分离、纯化机理、酶解工艺改进；,3.功能性肽的分离、分析技术开发；,4.肽的功能性生物学评价,5.生物活性肽功能性食品的开发。,目前肽类物质的应用,1.功能性食品：,具有一定功能的肽类食品，目前是国际上研究的热点。日本、美国、欧洲已捷足先登，推出具有各种各样功能的食品和食品添加剂，形成了一个具有极大商业前景的产业。,2.肽类试剂：,纯度非常高，主要应用在科学试验和生化检测上，价格十分昂贵。,3.肽类药物：,依据其功能，生物活性肽大致可分为生理活性肽、调味肽、抗氧化肽和营养肽等，但因一些肽具有多种生理活性，因此这种分类只是相对的。,