,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十四章,基 因 诊 断 和 基 因 治 疗,Gene diagnosis and Gene Therapy,第一节 基因诊断第二节 基因治疗,1,第十四章 基 因 诊 断 和 基 因 治 疗Gene,第一节 基因诊断,重组DNA技术极大地丰富了我们对人类遗传病分子病理学的知识，同时也提供了从DNA水平对遗传病进行基因诊断的手段。,基因诊断,：,就是利用DNA重组技术从DNA 水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷，又称DNA分析法。,2,第一节 基因诊断2,一、直接诊断,直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或邻近的DNA序列作为探针，或通过PCR 扩增产物，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。它主要适用于已知基因异常疾病,的诊断。,3,一、直接诊断3,1、Gene 缺失遗传病的诊断,1）地贫的Gene诊断,基因不同程度的缺失引起不同类型的地贫，基因缺失14个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个 Gene时可得到10kb片段。,BamHI,BamHI,2,1,2,10 kb,14 kb,probe,4,1、Gene 缺失遗传病的诊断BamHIBamHI21,以Gene为探针，Southern blot 方法检测,/-/-/-/-,正常 缺1 缺2 缺3 缺4,14kb,10kb,5,以Gene为探针，Southern blot 方法检测,2）DMD/BMD的缺失诊断（进行性肌营养不良或假肥大型）,DMD是一种严重致死性疾病（XR），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。BMD临床症状与DMD相似，但症状较轻。,Gene 定位Xp21，Gene 2300kb,79 个Exon，cDNA全长13974bp 编码3685 Aa，分子量427kD。,DMD/BMD 70%左右为缺失型，基因很大，缺失可能发生在不同的部位。应用多重PCR扩增检测，判断缺失状态。,6,2）DMD/BMD的缺失诊断（进行性肌营养不良或假肥大型）6,多重PCR扩增后电泳检测结果,病例,外显子,1 2 3 4 5 6 7 8,Pm,3,43,50,13,6,47,60,52,bp,535,113,7,多重PCR扩增后电泳检测结果病例外显子 1 2,2、突变型遗传病的基因诊断,例 如：,镰形细胞贫血的Gene诊断,已知突变基因编码珠蛋白链的,第6位密码子,GAGGTG,谷Aa缬Aa,8,2、突变型遗传病的基因诊断例 如：8,1）RFLP诊断,已知限制酶MstII,识别序列 MstII 1.15kb,CCTG,A,GG 1.35kb x,probe,CCTG,T,GG,突变后不能识别，,酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。,9,1）RFLP诊断已知限制酶MstII9,限制酶切片段电泳后，经Southern Blot检测，结果：,1.35kb,1.15kb,/S S/S,正常 镰状 镰状贫血,10,限制酶切片段电泳后，经Southern Blot检测，结果：,2）ASO探针诊断,已知突变Gene部位和性质，合成寡和苷酸探针，,32,P标记，进行Southern Blot 杂交/斑点杂交。,Normal,Gene Probe与正常,杂交,Mutation,S,Gene Probe与异常,S,杂交,11,2）ASO探针诊断 已知突变Gene部位和性质，合成,斑点杂交结果：,/,/,S,S,/,S,正常探针,突变探针,12,斑点杂交结果：/S,二、间接诊断,主要通过Gene和DNA多态的连锁分析作出诊断。当致病基因虽然已知，但其异常尚属未知时，或疾病Gene本身尚属未知时，可通过对受检者及其家系进行连锁分析，推断受检者是否获得了带有致病基因的染色体或DNA 片段。,连锁分析是基于,遗传标记与Gene连锁,，子代是否获得遗传标记间接地判断做出诊断。,这些遗传标记是基因组中的DAN 多态，如：,RFLP，VNTR 等。,13,二、间接诊断 主要通过Gene和DNA多态,1、Gene异常不明确的遗传病的诊断,例：成年型多囊肾病APKD，AD，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。,APKDGene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKD Gene与珠蛋白基因3端附近的一段小卫星DNA序列（3HVR）紧密连锁，因此，可以通过RFLP连锁分析进行诊断。,14,1、Gene异常不明确的遗传病的诊断例：成年型多囊肾病A,以3HVR为probe与PvuII酶切后的家系有关成员的Gene组DNA杂交Southern Blot杂交,Gene组DNA probe（3HVR）,PvuII酶切,DNA片段,杂交,结果,15,以3HVR为probe与PvuII酶切后的家系有关成员的,结 果,1 2,1 2 3 4 5,57kb,34kb,23kb,16,结 果 1,结果分析,患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,说明致病基因与3.4kb片段连锁,并按孟德尔方式遗传.II5不含3.4kb片段,产前诊断正常.,17,结果分析17,PCRRFLP诊断,甲型血友病的基因诊断，已知甲型血友病XR，获得家系成员基因组DNA。,PCR 142 bp,BcLI,142bp 99 bp 43bp,电泳,结果分析,？,p1,p2,142bp,99bp,43bp,Bcl I,Bcl I-,Bcl I+,18,PCRRFLP诊断p1p2142bp99bp43bpBcl,问:,1/,2、1诊断；,2/,1是男或是女发病？,142bp,99bp,1 2,1,2,3,III,1,19,问:1/2、1诊断；2/1是男或是女发病？142b,结果分析,1）先症者II2具有99bp片段而发病，该片段来自母亲。,2）II2有142bp/99bp杂合子。142bp来自父亲，为正常片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。,3）1为99bp片段,如果是 男性 为患者（99bp片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方）,20,结果分析1）先症者II2具有99bp片段而发病，该片段来自母,基因诊断意义,现证病人的诊断：争取有效、针对性治疗。,产前诊断：意义更为重要，预防遗传病患儿的出生,END,21,基因诊断意义现证病人的诊断：争取有效、针对性治疗。END2,