单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验三,1.,补体结合反应,2.,人外周血单个核细胞分离,3.,抗体制备,(3),实验三1.补体结合反应2.人外周血单,Test 1,补体结合反应（,Complement fixation Test,CFT,）,Test 1 补体结合反应（Complement fix,补体结合位点,补体结合位点,Fab,段,Fc,段,C1q,结合位点被屏障,结合抗原之前,C,H1,C,H2,暴露的,C1q,结合位点,结合抗原之后,IgM CH3,区，,IgG CH2,区,Fab段Fc段C1q 结合位点被屏障结合抗原之前 CH1,实验3-抗体制备-补体结合-PBMC分离课件,Ag+Ab,Binding to Complement,Ag+Ab+C,Activation of Complement,Lysis of target cells,Ag+AbBinding to ComplementAg,概念：,补体结合反应：,是指在,补体,的参与下，以绵羊红细胞（,SRBC,）和溶血素（抗,SRBC,的抗体）作为,指示系统,的,抗原抗体反应,。,概念：补体结合反应：,补反中包括,两个系统,五种成分：,待检系统：已知,Ag,或,Ab,、待检,Ab,或,Ag,及仅供一组,Ag-Ab,系统反应的定量补体。,指示系统：绵羊红细胞和溶血素。,原理：,补反中包括两个系统五种成分：原理：,待测系统,抗原,+,未知血清,1,2,补体,1,2,Step 1,抗原抗体复合物的形成,Step 2,补体的结合和耗竭,指示系统,SRBC+,抗,SRBC,抗体,Step 3,SRBC,的裂解,1,2,1,：,No Ab,；,2,：,Ab,待测系统1 2补体12Step 1 Step 2指示系统S,Ag,Y,待测血清,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Ab,阳性,No Ab,阴性,Ag,Ag,Ag,AgY待测血清 YYYYYYYYAbNo AbAgAgAg,抗原：伤寒菌裂解产物,待测血清：,56,，,30min,补体：豚鼠血清,2%,绵羊红细胞,溶血素,材料：,抗原：伤寒菌裂解产物材料：,方法：,1,2,3,4,5,试验管,血清,对照管,抗原,对照管,补体,对照管,SRBC,对照管,待测血清,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.4mL,0.8mL,抗原,补体,N.S,摇匀，,37,，水浴,15min,溶血素,SRBC,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,摇匀，,37,，水浴,15min,（,1,份,/2,人）,方法：12345试验管血清抗原补体SRBC待测血清0.2mL,预期结果：,1,管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。,溶血,不溶血,2.,试验管,血清对照管,抗原对照管,补体对照管,SRBC,对照管,？,溶血,溶血,溶血,不溶血,预期结果：1管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红,绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。,各种试剂的吸管不可混用。,注意事项：,绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。注意事项：,Test 2,人外周血单个核细胞分离,Test 2 人外周血单个核细胞分离,实验原理：,1.,密度梯度离心法,粒细胞和红细胞,(1.092g/l),分离液,(1.0770.002g/l),淋巴细胞单核细胞,1.070g/l,血浆层,外周血,淋巴细胞分离液,离心,2.,淋巴细胞分离液：聚蔗糖,-,泛影葡胺,实验原理：1.密度梯度离心法 粒细胞和红细胞分离液淋巴细胞,实验方法：,抽取,1.5ml,静脉血至肝素抗凝管，加入,1.5ml Hanks,液,混匀,取,3ml,稀释血，沿试管壁缓慢加入到,2ml,分离液中,2000rpm,，离心,20min,小心吸取淋巴细胞层，加入,2ml Hanks,液,2000rpm,，离心,10min,弃上清，加入,2ml Hanks,液,2000rpm,，离心,10min,弃上清，加入,2ml Hanks,液,细胞计数,实验方法：抽取1.5ml静脉血至肝素抗凝管，加入1.5ml,RBC,WBC,WBC,WBC,WBC,1mm,1mm,Cell concentration/ml,=Total cell count in 4 squares/4 x 10,4,Cell concentration/ml,=Total cell count in 5 squares x 5 x 10,4,RBCWBCWBCWBCWBC1mm1mmCell conc,注意,无菌操作,.,注意血制品污染,.,控制操作时间，保持细胞存活,.,应用水平离心机,.,注意无菌操作.,E-,花环形成实验,用于检测外周血,T,细胞的数量和比例,.,T,T,B,SRBC,CD2,E-花环形成实验 TTBSRBCCD2,实验3-抗体制备-补体结合-PBMC分离课件,结果,E-,花环形成率,形成花环的淋巴细胞数,=,淋巴细胞总数,(,形成和未形成花环的细胞总数,),正常范围,:60-80%,X 100%,结果E-花环形成率 X 100%,淋巴细胞增殖实验,外周血或分离的淋巴细胞,PHA,涂片染色,共培养,形态学观察,计算转化率,淋巴细胞增殖实验外周血或分离的淋巴细胞PHA涂片染色共培养形,Test 3,抗体制备,Test 3 抗体制备,方法,:,脱纤维绵羊红细胞（,SRBC,）,加入,3ml,生理盐水，混匀,2000rpm,离心，,5min,弃上清,制备绵羊红细胞溶液,30%,、,35%,、,40%,、,50%,取,0.1ml,皮下注射免疫小鼠,加入,3ml,生理盐水，混匀,2000rpm,离心，,5min,弃上清,方法:脱纤维绵羊红细胞（SRBC）加入3ml 生理盐水，混匀,