单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 重组体的筛选与鉴定,将目的基因与载体连接形成重组子,然后通过各种方法将重组子导入宿主细胞,得到所需要的带有重组,DNA,的转化子是基因工程的目的所在,.,何谓转化子,?,所谓,转化子,就是导入外源,DNA,后获得了新的遗传标志的,细菌细胞,或,其他受体细胞,.,为什么对重组子要进行鉴定筛选,?,在转化反应中,并非所有的细胞中都转入重组,DNA,分子,即使所有的受体细胞都变为转化体,所获得的转化子仍是多种类型的,DNA,分子,原因是在连接反应中会有以下几种情况发生,:,载体和一个或数个串联目的基因连接,载体发生自连,目的,DNA,分子发生自连,未发生连接反应的载体和目的,DNA,片段,(,更多,),为什么对重组子要进行鉴定筛选,?,因此,在成千上万个转化子中，真正含有期望的重组,DNA,分子的,比例很少,，为了将,含有,外源,DNA,的宿主细胞和,不含,外源,DNA,的宿主细胞,分开,，以及将含有,正确重组子,的宿主细胞和含有,其他外源,DNA,的宿主细胞,分开,，就需要设计出最易于筛选重组子克隆的方案并加以验证。,常用的重组子筛选和鉴定方法,重组子大小的鉴定,(,质粒,DNA,的快速提取鉴定,),重组子酶切图谱鉴定,(,限制性核酸酶酶切片段,大小鉴定,),DNA,序列分析,同源性分析鉴定,(,原位杂交,),质粒载体的抗性标记筛选,噬菌体包装容量的正性筛选,质粒载体的,互补筛选,(,蓝白色斑筛选法,),标记补救筛选,翻译产物,(,Western blot,),转录产物,(,Norther,blot,),其他方法,(,报告基因,),DNA,鉴定,载体,筛选,直接,筛选,间接,筛选,重组,子的,筛选,第一节 遗传学检测法,一、根据载体表型特征的筛选,根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体,DNA,分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是一种,比较简单而又十分有效,的方法。在,基因工程,中使用的所有载体分子,都,至少含有一个选择标记,。,质粒,常有,抗生素抗性基因,如,氨苄青霉素抗性基因（,Amp,r,）,、,四环素抗性基因（,Tet,r,）、卡那霉素抗性基因（,Kan,r,）,根据载体分子所提供的选择性标记进行筛选,是获得重组体,DNA,分子必不可少的条件之一。,在实际操作中,最典型,的方法是使用抗药性标记的,插入失活,作用,或是,-,半乳糖苷酶基因的显色反应,将重组体,DNA,分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来,.,而对于,噬菌体的置换型载体,来说,噬菌体头部外壳蛋白容纳,DNA,的能力是有一定限度的。其包装能力应控制在野生型,DNA,长度的,75%-105%,之间（,36-51kb,），这样才能,形成噬菌斑,。因此，包装限制这一特性，保证了体外重组所形成的有活性的,重组体分子，一般都应带有外源,DNA,的插入片段，,噬菌斑,的形成本身就是,重组体的一种筛选特征。由于这些方法都是直接从平板上筛选，所以又称为,平板筛选法,。,一、根据载体表型特征的筛选,（一）抗药性标记插入失活筛选法,检测外源,DNA,插入作用的一种通用方法是插入失活效应。,1.,以,pBR322,质粒为例,（,1,）,pBR322,质粒的一般特性,在,pBR322,质粒上有,两个,抗生素基因，,Amp,r,基因内有一个,Pst,限制性核酸内切酶的,唯一,识别位点，,Tet,r,基因内有,BamH,和,Sal,两种限制性核酸内切酶,单一,识别位点。,一、根据载体表型特征的筛选,（一）抗药性标记插入失活筛选法,1.,以,pBR322,质粒为例,（,2,）,筛选重组体的原理,在,Amp,r,和,Tet,r,这两个基因内的任一插入作用，都会导致,Amp,r,基因,或,Tet,r,基因,出现功能性,失活,，于是，所形成的重组质粒都将具有,Amp,s,Tet,r,或,Amp,r,tet,s,的表型。,当,外源,DNA,片段插入,pBR322,质粒,DNA,的,BamH,或,Sal,位点时，,抗四环素基因失活,（,Tet,r,Tet,s,），重组体转化子必定具有,Amp,r,Tet,s,表型,。因此，将转化菌先涂布在含有,Amp,的琼脂平板上,，并将存活的,Amp,r,菌落,原位影印,到另一个含有,Tet,的琼脂平板上,，凡是在,Amp,平板上生长,，而,不在,Tet,平板上生长的菌落,，就,必定是,已经插入了外源,DNA,片段的重组质粒转化子克隆,.,如下图所示,同样,在,pBR322,质粒的,Amp,r,基因序列中,利用,Pst,限制性核酸内切酶识别位点,插入外源,DNA,片段,也,能应用插入失活作用检测重组质粒,当然,所挑选,的菌落就应该是具有,Amp,s,Tet,r,的表型,一、根据载体表特征的筛选,（一）抗药性标记插入失活筛选法,pBR322,pBR322,pBR322,Amp,r,Tet,r,Amp,r,Tet,r,Amp,r,Tet,s,+,菌落原位影印,Amp,琼脂平板,Tet,琼脂平板,图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体,一、根据载体表特征的筛选,（二）,-,半乳糖苷酶显色反应,筛选法,1.,乳糖操纵子的结构,阻遏蛋白,-,半乳糖苷酶,-,半乳糖苷透过酶,-,半乳糖苷乙酰基转移酶,mRNA,mRNA,lacA,lacY,lacZ,lacO,P,ZYA,lacI,P,I,RNA,聚合酶,一、根据载体表特征的筛选,（二）,-,半乳糖苷酶显色反应,筛选法,2.,-,半乳糖苷酶显色反应筛选法原理,有许多质粒载体具有,-,半乳糖苷酶显色反应的检测功能,.,应用这些载体系列，当外源,DNA,插入,到它的,lacZ,基因,上时，可造成,-,半乳糖苷酶的失活效应,，就可通过大肠杆菌转化子菌落在添加,X-gal-IPTG,培养基中的,颜色变化,鉴别出重组子和非重组子。,一、根据载体表特征的筛选,（二）,-,半乳糖苷酶显色反应,筛选法,3.,举例,pUC,质粒,：带有,-,半乳糖苷酶基因（,lacZ,）的调控序列,和,-,半乳糖苷酶,N,端,146,个氨基酸的编码序列,。这个编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位点的多克隆位点，但并,没有破坏,lacZ,的阅读框架。,大肠杆菌菌株：,带有,-,半乳糖苷酶,C,端部分序列的编码信息。,在各自独立的情况下，,pUC,质粒和大肠杆菌编码的,-,半乳糖苷酶片段都没有活性。,一、根据载体表特征的筛选,（二）,-,半乳糖苷酶显色反应,筛选法,3.,举例,当质粒转化大肠杆菌后,可形成,具有酶活性,的蛋白质,它在生色底物,X-gal,的存在下被,IPTG,(,异丙基,-,-D-,硫代半乳糖苷,）诱导形成,蓝色菌落,。当外源片段,插入,到,pUC,质粒的多克隆位点上后，则会导致,读码框架改变,，表达蛋白,失活,，因此，在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成,白色菌落,。因此，根据这种,-,半乳糖苷酶的显色反应，可将重组质粒与自身环化的载体,DNA,分开。,二、根据插入基因遗传性状的筛选,(,一,),原理,重组体,DNA,分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果插入在载体分子上的外源基因,能够实现其功能性的表达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成,互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选,.,(,二,),举例,当外源目的基因为合成,亮氨酸的基因,时,将该基因重组后转入,缺少,亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅,缺少,亮氨酸的基本培养基上筛选,只有,能利用,表达产物亮氨酸的细菌才能,生长,因此,获得的,转化子,都是,重组子,.,将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在硝酸纤维膜上变性,带有目的基因的放射性,DNA,或,cDNA,作探针进行杂交,放射性自显影,杂交信号（,黑点）,对应的噬菌斑,即为阳性克隆,。,第二节 核酸分子杂交检测法,一、菌落印迹原位杂交,菌落印迹原位杂交的,优点,是：适于,高密度,菌落的筛选,对于噬菌斑平板,它可以连续影印几张同样的硝酸纤维滤膜,获得数张同样的,DNA,印迹。因此，能够进行,重复筛选,，,效率高,，,可靠性强,，而且可以连续使用,两种,或,数种探针,筛选,同一套,重组体,DNA,，是一种最常规的检测手段。,.,核酸分子杂交：,.Southern,杂交分析：,由英国,Southern,（,1975,）发明，,将琼脂糖中,DNA,转移到,尼龙膜,进行,DNA,分子杂交,分析的方法。,筛选基因库得到,阳性克隆,将限制性酶酶切与,Southern,杂交,结合,绘制限制性酶图谱,。,.Northern,杂交分析：,与,Sorthern,杂交的原理和,程序相同。,用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水,平，,检测,mRNA,的存在,。,第三节 物理检测法,重组质粒的快速提取与酶切鉴定,经过遗传筛选得到的阳性克隆还必须进一步进行鉴定，,酶切鉴定,是最常用的方法之一。,通过提取“,阳性克隆,”的质粒，酶切分析“阳性克隆”中质粒的,大小,和,酶切图谱,，通过这种方法鉴定载体中是否含有外源,DNA,片段，载体中是否含有正确的目的,DNA,片段。这种方法判断的,标准,是目的,DNA,分子和载体的分子大小及酶切图谱。,Mr,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,Mr:,DNA,分子,Marker,;,1,:,目的,DNA,片段,;,2,:,目的,DNA,片段,EcoR,酶切,;,3,:,空载体,EcoR,酶切,;,4-10,:,为不同,”,阳性克隆”质粒的,EcoR,酶切分析,;,从图中可看出,:,4,、,5,泳道,为不含插入片段的空载体；,6,、,9,泳道,虽然含有外源,DNA,片段，但因为插入片段的大小和酶切图谱与目的片段不同，所以为,假阳性,；,7,、,8,、,10,泳道,和,2,泳道,的电泳图谱相同（除空载体对应的条带外），所以是,阳性克隆,。,酶 切 鉴 定 克 隆 图,此外，还有其他方法，,如：,Western,杂交分析、,核酸序列分析,、,免疫化学检测法等,.Western,杂交分析：,用于,蛋白质,的分析,。,.,核酸序列测定,：,测定克隆后的,DNA,片段核酸序列,。,采用,Sanger,（,1977,）发明的,双脱氧核糖核酸,终止法,测定核酸序列。,在,Sanger,双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：,.,核酸序列分析：,测定的核酸序列是否为基因、有什么功能，需用计算机软件或生物学实验进一步分析。,.,同源序列的分析：,同源性比较：,将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上,比较基因间的同源性,，,将序列发送到,Blast,等,DNA Data,数据库进行比较。,无任何同源性的新序列,(,进行,基因功能性研究,的方法,),将基因导入生物体进行,基因失活,或,过量表达,，根据,表型,推测基因作用；,用,噬菌体显现,（,phage display,）技术,；,酵母双杂交,系统进行蛋白质的功能分析。,同源序列的分析：,阅读框架的分析：,一个,ORF,是一条能编码一条多肽链的,DNA,序列，具有翻译起始信号和终止信号等。,