,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九讲,病毒增殖技术,一,、,病毒的复制、增殖与营养,吸附：非特异性静电特异性受体,影响因素：温度、阴、阳离子,侵入：病毒直接进入胞浆；,细胞吞饮病毒；,病毒囊膜与细胞融合,脱壳,包括脱膜和脱衣壳、囊膜脂质与细胞膜融合，裸露的病毒体进入细胞浆内及衣壳被溶酶体消化裂解并释放出核心中的核酸,无囊膜病毒仅有脱壳过程,疱疹病毒则可能在细胞表面脱去囊膜，而痘病毒在吞饮泡内脱去囊膜,主要在胞浆和胞核内完成,生物合成：细胞浆或细胞核中完成,早期：合成酶类、核苷酸原料,晚期：合成病毒结构蛋白,装配：细胞浆或细胞核中完成,核酸、蛋白质盘曲浓缩多肽包壳 细胞膜的脂质、糖类和病毒蛋白病毒颗粒,释放：细胞通道溢出；细胞死亡自溶释出；,细胞膜出芽；细胞膨胀破裂放出,掌握不同病毒的增殖规律，获得高滴度病毒，对研制高质量生物制品十分重要。,二、动物增殖病毒技术,动物的选择：,1,大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗、青壮年和健康,2,对相应病毒易感，并十分敏感,3,经隔离饲养和观察检查证明健康,4,家兔、大、小鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标准；鸡应属非免疫鸡或,SPF,级标准；犬、猫应品种明确，并符合普通级实验动物标准,5,体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大,接种方法,1,皮内接种：注入表皮与真皮之间，小鼠、大鼠、地鼠可在背部、尾根部或趾部，豚鼠、兔在耳部，猴的结核菌素皮下接种在眼睑部,2,皮下接种：犬、猫多在大腿外侧，豚鼠在大腿内侧，兔在背部或耳根部,3,肌肉接种：肌肉发达、血管丰富的部位,4,静脉接种：大小鼠的尾静脉；兔耳缘静脉；犬、豚鼠前肢皮下静脉或后肢小隐静脉；灵长类可用股静脉、隐静脉、前肢皮下头静脉；山羊颈静脉，小型猪耳静脉、颈静脉或前大静脉，鸡翼下静脉，犬舌下小静脉,5,腹腔接种,6,脑内接种,三、禽胚增殖病毒技术,禽胚的选择,1 SPF,鸡胚：无鸡的特定的,22,种病原体,2,非免疫鸡胚：无特定病原的母源抗体,3,鸭胚：无干扰抗体的健康鸭胚,1,卵黄囊,2,卵白,3,尿囊腔,4,羊膜腔,5,气室,6,壳膜,（一）禽胚接种途径与收获,绒毛尿囊膜接种法,多用于嗜皮肤性病毒的增殖：痘病毒、新城疫和疱疹病毒,1,选择,10,13,日龄的鸡胚，划出气室和胚位,2,消毒后在气室部位钻一小孔，在鸡胚面避开血管钻一小孔，勿穿透绒毛尿囊膜,3,用橡胶吸球紧贴气室孔轻轻一吸，使鸡胚面小孔处的绒毛膜下陷造成人工气室,4,在人工气室孔注入,0.1,0.2ml,病毒液，轻摇鸡蛋使病毒液均匀散布于绒毛尿囊膜上,5,用石蜡封口，,35,37,培养,1,选用,10,13,日龄鸡胚,2,在气室部位距气室分界线,3,5mm,处打一小孔,3,用细针头斜向蛋壳面插入约,5mm,，再退出于气室内注射,4,封口后直立，,37,，,2h,，不翻蛋,5,常规孵化，每日照蛋,2,次，及时取出死亡胚,4,，,12h,收获,消毒后，去除蛋壳和壳膜，用灭菌镊子轻轻夹起绒毛尿囊膜，并沿气室周围将绒毛尿囊膜全部剪下，取病变明显部位，经研磨制成病毒悬液,尿囊腔接种,用于新城疫病毒、鸭传染性肝炎病毒和传染性支气管炎病毒,接种：,9,11,日龄鸡胚，划出气室边界，在胚胎距气室边界上或,/,和下,2,3mm,处做标记，消毒后，在标记处打孔，注入病毒液，封口，孵化,收获：,4,放置,6h,或,20 0.5,1h,，消毒，去除蛋壳，用灭菌吸管插入尿囊腔，取出尿囊液和羊水备用,卵黄囊接种法,5,8,日龄鸡胚，在气室中心壳上钻一小孔,针头沿胚的纵轴插入约,30mm,，封口，孵化,主要用于立克次氏体、鹦鹉热衣原体及某些病毒的增殖,收获：无菌撕破绒毛尿囊膜和羊膜，夹起鸡胚切断卵黄带置于灭菌平皿中。如系收获鸡胚则将鸡胚低温保存备用；如系收获卵黄囊则将内容物倒入平皿中，用镊子将卵黄囊及绒毛尿囊膜分开，用灭菌生理盐水冲去卵黄，取卵黄囊低温保存备用,羊膜腔接种法：,1,、操作在照蛋灯下进行，取,10,12,日龄鸡胚直立于蛋盘上，划出气室和胚胎位置,2,、在气室端靠近胚胎侧的蛋壳上钻孔，将注射器针头轻轻刺向胚体，当稍感抵抗时即可注入病毒液,将注射器针头刺向胚体，以针头拨动胚体下颚或腿，如胚体随针头的拨动而动，说明针头已进入羊膜腔，注射病毒液,3,、封口孵化，收获方法与尿囊腔接种方法同,病毒感染鸡胚全部组织，且可以通过胚体泄入尿囊腔,脑内接种法,1,、,8,13,日龄鸡胚，划出气室和胎位，在气室靠近胚胎侧的蛋壳上钻孔,2,、在绒毛尿囊膜上无大血管处切开一小口，用弯头镊子通过羊膜夹住鸡胚眼睑固定头部，注射器插入鸡胚注入病毒液,0.01,0.02ml,3,、无菌条件下取出鸡胚，低温保存备用,常用于狂犬病毒的增殖,胚体接种法,1,、接种方法同脑内接种,2,、针头刺入胚体内接种,静脉接种法,1,、,11,14,日龄鸡胚，照蛋，选取绒毛尿囊膜上大而直的静脉，并在蛋壳上划一长方形记号，并划出血流方向,2,、用蛋钻在注射部位开一长方形裂痕，除去蛋壳，于蛋壳内膜上滴一滴灭菌液体石蜡，使静脉透明可见,3,、用注射器顺血流方向刺入血管注入,0.05,0.2ml,病毒液，拔出针头可以不封口，孵化，弃掉,24h,内死胚,4,、收获时按脑内接种法沿反血流方向静脉插入针头，可得,0.05,0.5ml,血液，或去除气室蛋壳，滴一滴灭菌液体石蜡于蛋膜，通过蛋膜用针头刺破内部大血管，使血液渗出壳膜之上，用吸管吸取，可得,0.5ml,血液,（三）影响禽胚增殖病毒的因素,种蛋质量：,病原微生物：,污染制品本身，又影响接种病毒,在鸡胚中的增殖,母源抗体：,影响病毒在鸡胚内的增殖,抗生素：,影响病原体的增殖,孵化技术：,温度：,37,39.5,，宁低勿高,湿度：,鸡胚,53,57,水禽比鸡胚高,5,10,通风：,机械通风或定期开启恒温培养箱,翻蛋：,大头向上垂直放置，定期翻蛋，孵化至,4,7,天翻蛋,接种技术：,不同病毒有不同的接种途径，同种病毒接种不同日龄的禽胚获得的病毒量也不同；,尿囊腔接种时，根据病毒培养所需时间选择最恰当的接种胚龄；,严格操作，接种时不应伤及胚体和血管，以免影响其发育。,禽胚污染：,接种时应严格无菌操作,定期清扫消毒孵化室，保持空气新鲜,种蛋入孵前要清洗、消毒、晾干,细胞培养技术,概念：细胞培养,原代细胞、细胞株、传代细胞,细胞培养方法,静置培养、转瓶培养、悬浮培养、微载体培养、微囊化细胞培养,细胞制备：举例,CEF,制备过程,细胞的冻存与复苏：慢冻快融法,细胞培养要素,培养液、血清、细胞接种量、,pH,、温度、无菌条件、培养器皿清洁度,细胞培养污染问题,细菌、真菌、支原体、病毒,四、细胞增殖病毒技术,细胞的选择：,病毒须在敏感的宿主细胞中增殖,宿主细胞一般选择相应易感动物的组织细胞,可以根据病毒的细胞感染谱来选择细胞,细胞培养病毒要素,血清：,56,灭活,30min,，为了克服非特异性抑制因子的作,用，血清浓度不超过,2,温度：,37,pH,：,7.6,7.8,接毒量与接种方法：按维持液的,1,10,（,V/V),量接种；,异步接毒和同步接毒,支原体污染问题,影响病毒的增殖,1,干扰素诱导与干扰素活性抑制,2,病毒、支原体对共同营养需求成分的竞争,病毒增殖指标与收获,细胞病变（,CPE,）：细胞圆缩、细胞聚合、细胞,融合成合胞体、轻微病变,包涵体和血凝性,CPE,达到,80,左右时收获，反复冻融使病毒释放,